核糖体蛋白在骨肉瘤中的研究进展

陆禹严，贺茂林，罗书钜#

1玉林市第一人民医院脊柱骨病外科，广西 玉林 537000

2广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，南宁 530021

骨肉瘤起源于间叶组织，是最常见的原发性恶性骨肿瘤，平均年发病率为4.4/100万[1]，发病年龄呈双峰分布，分别于青春期和60岁后达到峰值。骨肉瘤好发于长骨干骺端，包括股骨远端、胫骨和肱骨的近端，以恶性程度高、易转移和复发为特征，是儿童和青少年肿瘤相关死亡的主要原因[2]。影响骨肉瘤患者预后的主要因素包括肿瘤部位、转移情况、手术切除的完整性及对放化疗的组织学反应等。既往骨肉瘤仅依靠手术治疗，5年生存率低于20%[3]，新辅助化疗和外科手术的飞速发展可使骨肉瘤患者的5年生存率提高至70%[4]，一旦发生肺转移，患者的5年生存率也仅有20%[5-6]。近20年来，骨肉瘤患者的生存率并没有进一步改善[7]，治疗已进入瓶颈期，从分子水平阐明骨肉瘤的发病机制、寻找可靠的药物靶点并研发安全有效的新型药物是目前迫切需要解决的问题。

核糖体蛋白是构成核糖体的重要成分，在细胞内蛋白质的合成中发挥关键作用。核糖体蛋白基因的正常调控对核糖体的精确合成和维持细胞的正常生长至关重要。既往研究认为，核糖体蛋白只在核糖体形成过程中起到维持核糖体RNA（ribosome RNA，rRNA）特殊结构稳定性和协助rRNA正确折叠的作用。研究表明，核糖体蛋白除了参与核糖体的组成外，还与翻译调控和正常细胞的恶性转化等多种核糖体外功能相关[8-9]。研究者在多种恶性肿瘤中均已发现核糖体蛋白基因的突变或表达模式的变化，包括白血病[10-11]、结直肠癌[12]、骨肉瘤[13]、胃癌[14]、肺癌及恶性胶质瘤[11,15]等，且核糖体蛋白参与了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和转移并与骨肉瘤患者的预后相关。本文就核糖体蛋白在骨肉瘤中的研究进展进行综述。

1 核糖体概述和核糖体的异质性

核糖体是蛋白质合成的场所，主要功能是促使信使RNA（messenger RNA，mRNA）和rRNA的相互识别，并将mRNA上的核苷酸序列翻译成多肽链上的氨基酸序列。翻译过程是在核糖体、转移RNA（transfer RNA，tRNA）及多种辅助蛋白质的协助下进行的。真核生物的核糖体由60S大亚基和40S小亚基组成。60S大亚基的成分包括5S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA和大约46种核糖体蛋白，而40S小亚基包含18S rRNA和大约33种核糖体蛋白。组成大、小亚基的核糖体蛋白分别称之为大亚基核糖体蛋白（ribosomal protein large subunit，RPL）和小亚基核糖体蛋白（ribosomal protein small subunit，RPS）。核糖体作为蛋白质合成的装配机，既往被认为是一种静态的实体，但近年来人们越来越清晰地认识到核糖体存在异质性，它的活动受到高度调控，且某些原癌基因蛋白和抑癌因子，如磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称 AKT）、MYC、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）、p53及RB等，已被证实调控了核糖体生物合成或蛋白质翻译起始[16-18]。

导致核糖体异质性的机制是多方面的。为适应外部环境的变化，细胞可以改变核糖体蛋白的表达水平或产生不同核糖体蛋白组成成分的核糖体，也可以使rRNA在转录后或核糖体蛋白在翻译后的修饰模式发生变化[9,16-17]。核糖体异质性可导致核糖体病甚至形成肿瘤。核糖体病以各种先天性缺陷和肿瘤易感性增加为特征，这类患者体内存在核糖体蛋白基因的突变或rRNA转录后修饰的变化，如Diamond-Blackfan贫血症中RPS19、RPS17及RPS24基因突变，5q-综合征中RPS14杂合性缺失及先天性角化不良1（dyskeratosis congenita 1，DKC1）基因突变使rRNA特定位点的假尿嘧啶化修饰异常，这类患者发展为白血病的风险明显增高[8]。此外，人类肿瘤中也经常出现核糖体蛋白基因的表达异常，如前列腺癌中RPL7A、RPL19、RPL37的过表达[19-20]，鼻咽癌中RPL27、RPL37A和RPL41的低表达[21]。与正常细胞相比，肿瘤细胞的核糖体异质性尤为突出并可能与肿瘤细胞的功能相关，这种差异可能为抗肿瘤治疗开辟新的途径。

2 核糖体蛋白在骨肉瘤中的表达变化和对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

骨肉瘤中存在糖体蛋白基因的表达异常已得到多项研究的证实。Zhang等[22]发现RPS15A的表达敲减明显抑制了人骨肉瘤U2OS细胞的体外增殖和克隆形成，且明显增加了G0/G1期的细胞数量。Nagao-Kitamoto等[23]研究证实，骨肉瘤组织中RPS3的表达明显高于正常骨组织，且RPS3在侵袭性骨肉瘤细胞株中的表达水平高于非侵袭性骨肉瘤细胞株，RPS3高表达与原发性骨肉瘤的肺转移相关。RPS3的敲减或过表达能够明显抑制或增加骨肉瘤细胞的迁移，且GLI2敲减的U2OS细胞中RPS3表达显著下调，GLI2敲减导致的骨肉瘤细胞迁移率降低可以通过RPS3过表达来恢复。该研究表明，RPS3作为Hedgehog信号通路下游转录因子GLI2的靶基因而参与了骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。Cheng等[24]研究表明，RPS9在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞株中高表达且表达水平与Enngin分期和肿瘤复发率呈正相关，RPS9低表达在体外抑制了骨肉瘤细胞的增殖和集落形成能力并诱导细胞发生G1/S期阻滞，而RPS9高表达通过激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路促进了骨肉瘤细胞的增殖。

研究显示[13]，RPL34在骨肉瘤中的表达模式发生了变化，对11例骨肉瘤患者的骨肉瘤组织和癌旁组织样本的定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测发现，63.64%的骨肉瘤组织中RPL34表达水平明显高于相应癌旁组织；免疫组化检测发现，95例骨肉瘤患者的骨肉瘤组织标本中，78.95%呈RPL34强阳性表达，21.05%呈RPL34弱阳性表达，而60例正常骨组织的RPL34均为弱阳性表达；生存分析结果显示，RPL34高表达患者的3年生存率明显更差。RPL34表达敲减明显抑制了人骨肉瘤Saos-2细胞的增殖和克隆能力，诱导了Saos-2细胞的凋亡并将细胞周期阻滞于G2/M期。基于加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz，UCSC）数据库的转录因子预测和STRING数据库的蛋白-蛋白互作分析表明，RPL34基因受原癌基因蛋白MYC的转录调控，其编码的蛋白与真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）的亚基发生相互作用，这提示RPL34可能通过MYC/RPL34/eIF3亚基信号转导通路参与骨肉瘤细胞的增殖调控。

核糖体蛋白基因也可以在骨肉瘤中低表达。Zheng等[25]对47例骨肉瘤组织、12例骨良性病变组织以及8例正常骨组织样本的检测发现，骨肉瘤组织和人骨肉瘤MG-63细胞中RPL7A的表达水平明显低于骨良性病变组织和正常骨组织。RPL7A低表达与血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）升高相关，RPL7A低表达是骨肉瘤肺转移患者的预后不良标志物。骨肉瘤中RPL7A低表达可能与9号染色体上基因的杂合性缺失有关。

3 核糖体蛋白调控骨肉瘤细胞生物学行为的可能机制

3.1 核糖体蛋白参与原癌基因或抑癌基因介导的信号转导

核糖体蛋白参与原癌基因蛋白介导的信号转导的最典型例子是RPS6。多种恶性肿瘤患者均存在PI3K/AKT/MTOR信号通路的失调，骨肉瘤患者常出现该信号转导通路上某些成分的活性异常或突变[26-27]，并在骨肉瘤细胞的增殖、分化、凋亡和患者的预后评估中发挥重要作用。PI3K可以被活化的大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）通路、有丝分裂原、生长因子和应力状态等多种刺激所激活，活化的PI3K募集并磷酸化激活下游分子AKT，后者主要通过激活MTOR来调控mRNA的翻译。MTOR能够通过磷酸化的4EBP1和S6K1来激活eIF4E和RPS6，最终促进含5'TOP结构的mRNA的翻译起始、延长和细胞周期的进程。这类含5'TOP结构的mRNA包含多种核糖体蛋白、延长因子和涉及核糖体生成或翻译调控的蛋白质[17]。肿瘤细胞的快速增殖需要更多的核糖体成分和更高效的翻译机制来维持，而PI3K/AKT/MTOR信号通路介导的翻译调控机制可能满足了肿瘤细胞的这种需求。

MYC是一种通过调控转录进程来调节细胞生长的重要原癌基因蛋白。参与核糖体和蛋白质合成过程的某些成分的编码基因在转录水平也受MYC调控，如核糖体蛋白基因、核糖体生成所需各种因子以及细胞增殖、分化和凋亡相关的因子[17]。MYC通过修饰这些因子的表达而调控核糖体生成和特定mRNA的翻译并改变核糖体蛋白和rRNA的总量，导致基因组的不稳定和肿瘤的发生[9]，在MYC过表达的肿瘤细胞中，表达上调的基因绝大部分是参与核糖体大小亚基构成的核糖体蛋白基因[28-30]。此外，MYC还可以通过富集eIF4E、eIF4G、eIF4A和eIF3的亚基来上调核糖体蛋白基因的表达并促进核糖体蛋白与翻译起始因子的相互作用[9]。这与MYC/RPL34/eIF3信号转导通路介导骨肉瘤细胞增殖调控的研究推测相一致[13]。近年来已有研究表明，eIF3的不同亚基eIF3b、eIF3c和eIF3h与骨肉瘤细胞的增殖或凋亡相关[31-33]。因此，调控蛋白质合成可能是MYC调节细胞生长和驱动肿瘤生成的重要机制。

包括骨肉瘤在内的约50%的人类恶性肿瘤中存在肿瘤抑制基因p53的突变或缺失[34]。在MYC等原癌基因异常活化或核糖体蛋白基因突变、rRNA合成抑制导致核糖体生成障碍等应激条件下，部分核糖体蛋白以游离的形式增多（如RPL5和RPL11）并与鼠双微体2同系物（mouse double minute 2 homolog，MDM2）相互作用从而抑制了MDM2对p53的泛素化降解，p53的稳定和活化最终诱导了细胞周期阻滞、细胞凋亡和自噬、DNA损伤修复、肿瘤生成抑制；此外，肿瘤抑制因子p14ARF也可以通过RP与MDM2结合而抑制其介导的p53泛素化降解[8]。因此，RP/MDM2/p53信号转导通路在抑制肿瘤生成中发挥了重要作用，但骨肉瘤细胞中何种核糖体蛋白基因突变或表达异常导致RP/MDM2/p53信号转导通路失调进而介导肿瘤的生成和进展仍需要更多试验数据来证实。

3.2 参与肿瘤相关特定基因的翻译起始调控

翻译过程包括起始、延长、终止和再循环4个阶段，起始是限速步骤和涉及翻译调控的主要步骤。在翻译起始阶段，40S小亚基需要多种eIF的协助才能与mRNA结合。首先是mRNA的5'帽结构与 eIF4E结合，后者再与eIF4G结合并通过 eIF3的桥接作用将mRNA定位于40S小亚基上，从而起始翻译。起始因子eIF4E、eIF4G和eIF4A共同构成三聚复合物eIF4F。这种依赖eIF4F和5'帽结构的翻译大约占细胞内总翻译的90%。MYC过表达能够促进eIF4F的形成，而激活的eIF4F能够极大地刺激与肿瘤调控相关并依赖5'帽结构的mRNA的翻译[31]。但这种调控机制是否涉及起始因子与核糖体蛋白的相互作用仍未明确，如MYC是否可能通过调控RPL34的转录及RPL34与eIF3亚基的相互作用而影响骨肉瘤细胞增殖相关mRNA的翻译[13]，目前仍不清晰。此外，在核糖体蛋白基因突变或表达异常导致核糖体压力、有丝分裂原刺激和营养压力等应激条件下，5'帽结构依赖的翻译机制受到抑制，细胞可以利用特定mRNA 5'端的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites，IRES）来促进mRNA与40S小亚基的结合而起始翻译过程[35-36]。虽然IRES介导的翻译只占细胞内总翻译的10%，但MYC、p53和p27Kip1等肿瘤相关基因mRNA的5'端也包含IRES[37-38]，这表明IRES依赖的翻译可能是肿瘤细胞在应激状态下的重要翻译机制。因此，靶向作用于翻译起始是一种潜在的肿瘤治疗策略。

3.3 调控肿瘤细胞的凋亡和细胞周期进程

细胞周期检查点是保证DNA复制和染色体分配的质量、维持基因组稳定的重要机制，主要包括G1/S期检查点、S期检查点和G2/M期检查点等。在细胞周期进程中，任何原因引起的异常事件如DNA损伤等，将导致细胞周期检查点的激活，进而中断细胞周期的进程并进行修复，如损伤无法修复，细胞将启动凋亡程序并诱导细胞凋亡。骨肉瘤细胞中核糖体蛋白表达失调导致的核糖体合成异常已被证实是细胞周期进程中的异常事件而阻滞了细胞周期[13,24]。RB、p53在G1/S期和G2/M期检查点的正常调控中发挥着至关重要的作用，但骨肉瘤细胞中存在RB、p53的突变或表达缺乏[39-40]，导致细胞周期检查点的调控功能丧失，使核糖体蛋白表达异常的肿瘤细胞能够避开检查点的监督而继续进行DNA复制和细胞分裂，最终令无限增殖成为可能[41]。

4 小结与展望

虽然有原癌基因蛋白和肿瘤抑制因子已被发现在转录或翻译起始水平调控了核糖体蛋白基因的表达进而影响了骨肉瘤细胞的生物学行为，而且这种潜在的机制可能是通过靶向特定的mRNA来实现。但在骨肉瘤细胞内连接原癌基因蛋白或肿瘤抑制因子、核糖体蛋白与转录和翻译起始以及细胞周期检查点的分子机制仍需要更多令人信服的研究来阐明。靶向作用于核糖体蛋白从而抑制细胞的蛋白质合成可能是一种具有重大意义的抗肿瘤治疗策略。可以预见的是，当那些能够被利用成为治疗靶点的核糖体蛋白得到充分认识后，更有效的骨肉瘤靶向治疗药物的研发将成为可能。