蓝隐藻藻蓝蛋白亚基的分离及特性研究

任慧慧,王玉璇,李雪薇,陈 敏

(烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005)

隐藻(cryptophytes)是一类单细胞、营自养生活的真核浮游藻类,是真核红藻与异养真核宿主经过第二次内共生后形成的[1-2]．部分隐藻在进化地位和光合系统结构组成上都显得比较特异,不仅含有叶绿素(chlorophyll,Chl)a、c,还含有隐藻藻胆蛋白．

目前有报道认为,一种隐藻仅留有一种藻胆蛋白[3],或藻红蛋白(phycoerythrin,PE)或藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)．已经发现的隐藻藻胆蛋白根据光谱性质的不同共分为8种:分别为藻蓝蛋白PC569(或PC570)、PC577[4]、PC612、PC630、PC645,藻红蛋白PE545、PE555、PE566[5]．目前的报道显示其特点为:(1)都至少含有α1,α2和β 3种发光亚基,但没有发现含有类似红、蓝藻藻胆蛋白的γ亚基[4];(2)一般以稳定的异二聚体(α1β)(α2β)形式存在于类囊体腔中,而非研究较多的红、蓝藻藻胆蛋白的三聚体或六聚体;(3)隐藻藻胆蛋白含有6种藻胆素色基,其中中胆绿素MBV (mesobiliverdin,最大吸收波长697 nm)、CB-618色基(最大吸收在618 nm)以及一种CB-584 色基(最大吸收在584 nm)是红、蓝藻藻胆蛋白所不具备的;(4)隐藻藻胆蛋白的α亚基分子质量较小,且只含有一种MBV色基,而β亚基则可能含有2～3种色基[6]．

目前的报道大多以隐藻藻胆蛋白异二聚体形式为研究对象[7-10],而对于拆分、纯化后的亚基的特性以及如何保持活性等却鲜有报道．实验室前期工作中发现[11],蓝隐藻(C.plaoidea)PC645中可能存在新的发光亚基,作者命其名为β2,但尚未给出氨基酸序列．本文以蓝隐藻纯化后的藻蓝蛋白PC645为材料,摸索了大规模分离和纯化活性亚基的方法,并对所得富含α和β亚基组分的光谱特性、多肽组成、等电点特性和pH耐受性等进行了研究,为了解藻蓝蛋白的亚基结构、能量传递等提供相应理论依据,并为进一步的亚基序列分析奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 PC645的分离纯化

蓝隐藻(C.plaoidea)的培养、PC645的分离和纯化实验条件参照文献[12],收集A645/A280大于等于7.0的80%硫酸铵饱和度的PC645样品,经光谱分析和非变性凝胶电泳鉴定纯度后,避光保存于4 °C备用．

1.2 光谱分析

藻蓝蛋白样品用50 mmol/L, pH值为7的PBS缓冲液调整浓度至A645=15;拆分后的亚基采用含4 mol/L尿素的相同缓冲液调整浓度至A360=0.5左右,分别使用TU-1900紫外-可见分光光度计和LS55荧光分光光度计分别测定其吸收及荧光光谱．

1.3 非变性凝胶电泳

非变性电泳的实验方法参见文献[13],以检测PC645纯度．

1.4 PC645的尿素变性

用(50 mmol/L, pH值为7的PBS)调整PC645至A645=10,配成含有4 mol/L和8 mol/L尿素的溶液分别变性48 h后测定吸收光谱．

1.5 亚基的分离纯化

Sephacryl S-100凝胶层析分离藻蓝蛋白PC645亚基的实验条件参照文献[14],上样量调整为3 mL,以50 mmol/L,pH值为7,含4 mol/L尿素的PBS缓冲液洗脱,流速为12 mL/h,并分别绘制亚基的洗脱曲线．

1.6 SDS-PAGE

将经过Sephacryl S-100凝胶层析分离收集到的亚基样品按照样品∶5%SDS溶液=100∶1(V/V)的比例混合处理1 h后进行SDS-PAGE,电泳条件参见文献[7]．

1.7 等电点聚焦(IEF)电泳分析

纯化后的PC645以及经SephacrylS-100凝胶层析分离后收集到的亚基样品,参照文献[7]进行IEF电泳分析其等电点特性．

1.8 亚基pH耐受性摸索

将8 mol/L尿素变性后得到的α与β亚基样品,分别采用66.7 mmol/L(pH值分别为4.92,5.91,6.98,8.04)的PBS缓冲溶液调整至相应pH值,保存于4 °C,分别于7 d、45 d和90 d取样测定吸收和荧光光谱,了解拆分后亚基的pH耐受性．

2 实验结果

2.1 藻蓝蛋白PC645的分离纯化

80%硫酸铵饱和度下的藻蓝蛋白经2次分子筛纯化后的吸收光谱(图1(a)实线)呈现典型的隐藻PC645的特征吸收,其中580、625、645 nm峰分别源于二氢胆绿素DVB(dihydrobiliverdins)、中胆绿素MBV和藻蓝胆素PCB(phycocyanobilins)色基的吸收[15];350～ 400 nm为藻胆蛋白四吡咯色基的吸收区;图中280 nm吸收峰与脱辅基蛋白的吸收有关,样品A645/A280的比值可以达到7或以上．非变性电泳图谱显示,PC645样品在紫外光下(图2(a))呈现单一荧光条带;经考马斯亮蓝染色并脱色后,在白光下(图2(b))也只呈现1条蛋白带,证明藻蓝蛋白样品被充分纯化,纯度可满足后续实验的要求．

图1PC645的吸收光谱和荧光光谱(激发谱Em=700 nm,发射谱Ex=580 nm)

Fig.1 Spectral and fluorescence spectra of purified PC645 (Excitation spectra,Em=700 nm. Fluorescence emission,Ex=580 nm)

图2PC645非变性电泳在紫外灯下和自然光下考染结果

Fig.2 The native-PAGE profiles of PC645 under UV light or observed by Coomassie brilliant blue staining under natural light

PC645在580 nm激发光下,只产生一个660 nm的特征荧光发射峰(图1(b)虚线)．在给定发射波长700 nm时,只产生属于藻蓝蛋白PC645的特征荧光激发峰(图1(b)实线),而没有属于叶绿素的激发峰．说明纯化后的PC645蛋白无变性,且亚基内部色基结合状态完好．

2.2 尿素变性拆分藻蓝蛋白亚基

4 mol/L尿素变性后的PC645样品在可见光区的580、625和645 nm特征吸收峰值明显降低(图1(a)),但基本形态未发生明显改变,表明仍有一定比例的PC645维持异二聚体状态;而8 mol/L尿素变性的PC645样品在此处的特征吸收峰接近完全消失(图1(a)),呈现一个620 nm左右的单峰,这是亚基拆分后色基吸收叠加的效果,显示蛋白四级结构已完全解体．

此外,2者在350～400 nm左右四吡咯色基的吸收峰均有所变化,但较之未变性状态时增高幅度很小,表明拆分后的亚基中的色基所处的蛋白微环境没有明显变化,三级结构较完整,色基没有明显暴露．因此在本实验条件下,可以实现对PC645亚基的拆分,并同时保持拆分后亚基的完整状态,只是8 mol/L比4 mol/L尿素可使PC645变性更加完全．

2.3 藻蓝蛋白亚基的分离纯化

经4 mol/L及8 mol/L尿素变性后的PC645的洗脱曲线(图3)均呈现较为明显的2个洗脱峰,先洗脱下来的为分子质量更大一些的蓝色组分,洗脱体积分别为30 mL(blue-1)和40 mL(blue-2);之后洗脱下的为分子质量相对小一些的绿色组分的洗脱体积分别为37 mL(green-1)和45 mL(green-2)．4 mol/L尿素变性的PC645亚基的洗脱体积要明显小于后者,可能与蛋白变性不完全,因此分子质量较大有关．

Fig.3 The eluting curves of sephacryl S-100 chromatography

2.4 藻蓝蛋白亚基的特性分析

2.4.1 吸收光谱 凝胶层析分离得到的蓝色组分(blue-1和2)和绿色组分(green-1和2)分别呈现相似的吸收特性(图4)．blue-1和2在600 nm处较宽的吸收峰,应该是DBV(最大吸收为590 nm)和PCB(最大吸收峰为620～650 nm)色基吸收叠加造成的,因此蓝色组分应为富含β亚基的洗脱组分．其四吡咯色基的吸收主峰在360 nm附近,此外还有一个420 nm左右肩峰．而green-1和2结合的四吡咯色基与前者不同,吸收在300～400 nm之间,主峰位于391 nm附近,此外440 nm附近另有一个较弱的吸收肩峰．在500 nm以上区域的最大吸收峰值较β亚基吸收波长更长,主峰分布在600～700 nm,可认为是625 nm和694 nm 2个吸收峰叠加的结果,前者是结合在α亚基上的MBV引起的,而后者源于独立的MBV色基[16],因而绿色组分应是富含α亚基的洗脱成分．

2.4.2 荧光光谱 4种亚基洗脱样品的荧光光谱特性如图5所示．在580 nm激发光下,blue-1和2(富含β亚基)都在660～670 nm附近产生的一个较宽的荧光发射峰(图5(a)和(b)实线),与PC645的特征荧光发射相类似,应该是在β亚基上共价结合的DBV和PCB色基按照能级顺序将它们吸收的光能依次传递,最终到达末端色基PCB(β82)后产生的末端发射峰,说明拆分后得到的β亚基上各色基依旧保持生物学活性状态且有序排列．green-2组分(图5(b)虚线)没有出现属于PCB色基的660 nm末端荧光发射;而green-1(图5(a)虚线)中的660 nm 发射可能源于少量残留的β亚基．变性后得到的blue-1和2(β亚基组分)的激发谱类似(图5c,d的实线),在700 nm发射波长下,均在605 nm和655 nm有一个较宽的荧光激发峰,对应于β亚基上的PCB和DBV色基;green-2(图5(d)的虚线)在700 nm发射波长下无明显的荧光激发峰,而green-1(图5(c)的虚线)在600～655 nm左右呈现不明显的起伏,进一步说明green-2对700 nm荧光没有贡献,应是不含β亚基的纯化的α亚基组分．

2.4.3 SDS-PAGE 在紫外光和考染后白光下blue-1和2的SDS-PAGE图谱(图6(a))均显示2条β亚基条带,β1分子质量为17.8 kU,β2为15.9 kU,但在8～10 kU未见有α亚基组分,显示亚基基本纯化;8 mol/L尿素变性后的green-2只呈现10 kU(α1)和8 kU(α2)2条带(图6(b)),但4 mol/L尿素处理的green-1在15～20 kU区仍然有β亚基成分．显然8 mol/L尿素浓度可令PC645(A645=10)变性更加彻底,使后续2种亚基在层析后达到完全分离的效果．

2.4.4 IEF PC645样品经过IEF电泳可被拆分成多个等电点不同的条带(图7(a)),其中主要有pI 9.1(α1亚基)、pI 7.1(α2亚基)、pI 6.0(富含β1亚基)及pI 5.7(富含β2亚基)4个荧光条带．纯化后的β亚基(blue-2)也得到了两种等电点(pI 6.0/5.7)不同的β亚基(图7(b)),说明PC645的β亚基组成并非单一组分．但没有等电点高于6的荧光成分,进一步证实层析后所得蓝色β亚基组分已完全排除了α亚基．

2.5 拆分后亚基的pH值耐受性

吸收光谱监测表明,α(green-2)亚基在不同pH条件下,吸收幅度均会随保存时间的延长而相继降低(图8(a),(b),(c),(d)),7 d左右在最大吸收391 nm处吸收值随pH值升高分别降至α原液的45%、53%、54%、55%左右,但吸收峰仍维持原有的基本形态;贮存45 d后424 nm处的特征吸收肩峰开始消失,光谱形态出现变化,表明亚基开始变性,三级结构不再完整．只有pH值为6.98时储存90 d的光谱,424 nm肩峰仍可见,说明α亚基储存的pH条件以6.98最佳．

图8(e),(f),(g),(h)显示,在pH值为6.98和8.04条件下,β(blue-2)亚基吸收幅度不仅会随时间延长而降低,且在储存45 d后,吸收峰形态明显变化,于360 nm和600 nm处吸收峰均明显蓝移,说明亚基三级结构变化,色基周围蛋白的微环境遭到破坏;在pH值为4.92和5.91时,7 d内吸收幅度在600 nm处吸收值可维持至β原液的89%和84%,但在45 d范围内光谱形态仍能维持原有的基本形态．可见,β亚基在pH值为5～6条件下的耐受性较好．

亚基的荧光光谱显示纯化后的α亚基(green-2)在580 nm激发光下没有荧光发射,而β亚基(blue-2)则产生660～666 nm的荧光,类似于PC645的特征荧光峰．相对于β原液,该荧光强度在pH值为4.92和5.91条件下保存7 d后即相对降低,但90 d后亚基发射峰位仍基本维持在相应范围内(图9(a)),特别是pH值为4.92时发射峰形态与原液基本一致,且在605 nm附近的激发峰位也无明显变化(图9(b)),说明此时部分亚基内部色基的能量传递依然在正常生理状态．在pH值为6.98条件下,7 d开始荧光发射峰和激发峰的形态即发生变化(图9(c)),90 d时亚基666 nm发射峰位蓝移至632 nm,激发峰也蓝移至590 nm附近(图9(d)),显然此时β亚基三级结构解体,DBV和PCB色基附近蛋白的微环境改变．综上可见β(blue-2)亚基在pH值为4.92时耐受性最佳．

3 讨 论

隐藻借助其特殊的色素成分,组装形成2套性质不同的捕光体系,分别是处于膜上、脂溶性的Chl a/c-蛋白复合物,和处于膜腔中、水溶性的藻胆蛋白,因而在光合系统结构和能量传递方式上必然具有特殊性．与红藻和蓝藻藻胆蛋白相比,隐藻藻胆蛋白不仅在叶绿体中的存在部位迥异、组装方式不同、亚基的种类和大小也不同[17]．据报道,隐藻藻胆蛋白的β亚基由叶绿体基因编码,可能与红、蓝藻藻红蛋白的β亚基同源;而α亚基则是由一组小的核基因家族编码,不仅分子质量只有正常β亚基的一半,且与已知的红、蓝藻藻胆蛋白各种亚基的序列仅有15%～20%的相同氨基酸残基,属于一类特殊的、不同于其他天线多肽的藻胆蛋白类型[18-19]．2种亚基组装形成的异二聚体作为稳定存在的基本单元,是否可进一步聚合目前没有定论,异二聚体与类囊体膜或者叶绿素蛋白复合物是否相接触、以哪种亚基接触也还存在争议．总体来说目前有关隐藻藻胆蛋白的报道相较于研究较为透彻的红、蓝藻藻胆蛋白要少得多,尤其异二聚体之外的其他存在形式还有待进一步研究．

实验以纯化的蓝隐藻(C.plaoidea)PC645为材料,经尿素变性拆分后进行Sephacryl S-100分子筛层析,分离得到了α和β 2类不同亚基,SDS-PAGE与IEF电泳结果证实,8 mol/L尿素处理48 h的PC645样品(A645=10)经层析后得到的α与β亚基组分达到了完全分离的效果．

光谱分析显示,分离后的α和β亚基依然保持光谱活性,蓝色的β亚基(blue-1和2)在可见光区吸收主要在600 nm处,而近紫外区四吡咯基团的吸收主峰在360 nm附近,此外还有一个400～420 nm的肩峰;而纯化的α亚基的四吡咯色基吸收主峰位于390～391 nm,在440 nm附近另有一个较弱的吸收肩峰,见光区最大吸收峰波长长达640 nm附近,是含有MBV色基而产生的吸收特征．

PC645内部只有3种色基,但是这些色基在蛋白内部的构象、能量传递途径等报道一直相互矛盾,至今未能完全统一．由于从PC645的α亚基中分离而得的MBV发色团最大吸收峰位于697 nm,因而一度被认为是PC645内部最低能级的色基[20];但后期的超快光谱研究认为位于β亚基上的PCB (β82)对应于PC645的643 nm处吸收峰,是最低能级色基,PC645内部色基吸收的能量按照DBV→PCB (β158)→PCB (β82)顺序传递,并产生660～662 nm末端发射[21]．至于α亚基上的MBV可能接受来自DBV的激发能,并传递给PCB (β158)色基[22],但也有报道MBV不能接受DBV的能量,且只能将激发能传递给PCB (β82)[23]．实验纯化的β亚基在580 nm激发光下产生660 nm荧光,而纯化后的α亚基(green-2)没有末端荧光发射,只有4 mol/L尿素变性不完全而沾染了β亚基(grren-1)的情况下才能观察到660 nm荧光,这一结果说明α亚基上的MBV吸收的能量需要传递给β亚基才能产生末端发射,为β亚基是PC645的末端发射位点提供了直接证据．

blue-1、2组分均被发现含有2种分子质量(17.8 kU/15.9 kU)和等电点(pI 6.0/5.7)不同的荧光条带,说明PC645存在2种β亚基,其中β2亚基与实验室前期对PC645的报道相一致[11],但其他的实验室未有报道．

蛋白质以及亚基的空间折叠状态受多方面因素的影响,包括pH值、离子强度、保存浓度等．隐藻藻胆蛋白处于类囊体腔内,伴随着光合作用的光反应的进行,质子泵工作的结果将使腔内的pH值从pH=7的正常生理条件逐步酸化,因此pH值对PC645的状态影响将是重要因素．前期实验室的工作结果显示,PC645异二聚体可在pH值为3～10范围内保持稳定或变性可逆性,并且pH值为4～7的酸性条件有利于隐藻PC645的活性状态．实验通过连续监测拆分后的亚基在不同的酸性pH条件下保存后的吸收以及荧光光谱的变化,发现α与β亚基的最佳pH储存条件分别为6.98和4.92,时间在一周内为佳,在45 d以内可以维持基本活性．显然拆分后亚基的pH耐受范围与异二聚体并不完全一致,可能与2种亚基各自的酸碱性或等电点不同有关．上述实验结果实现了对隐藻活性亚基的大规模分离,为今后亚基序列分析以及亚基的基本结构与能量传递功能关系研究奠定了基础．