人胎脑额叶和海马中星形胶质细胞的发育性变化

杨蓬勃，张军峰，张建水，徐 曦，肖新莉，刘 勇

(1.西安交通大学医学院神经生物学研究所/人体解剖与组织胚胎学系，陕西西安 710061；2.西安医学院人体解剖学教研室，陕西西安 710021)

◇基础研究◇

人胎脑额叶和海马中星形胶质细胞的发育性变化

杨蓬勃1，张军峰2，张建水1，徐 曦2，肖新莉1，刘 勇1

(1.西安交通大学医学院神经生物学研究所/人体解剖与组织胚胎学系，陕西西安 710061；2.西安医学院人体解剖学教研室，陕西西安 710021)

目的探讨人类胚胎期大脑额叶、脑室区(ventricular zone，VZ)/脑室下区(subventricular zone，SVZ)以及海马内星形胶质细胞的分布规律及形态特征。方法将收集的引产胎儿按胎龄分为4组：9～11周，14～16周，22～24周和32～36周。切取额叶、VZ/SVZ和海马部位的脑组织，固定后制作冰冻切片，免疫组织化学染色后观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞的分布及形态。通过GFAP和nestin免疫荧光双标染色剔除GFAP阳性的神经干细胞。结果①在皮质，9～11周时GFAP阳性细胞主要位于VZ、SVZ和中间带(intermediate zone，IZ)内；14～16周时其位于VZ最内层、IZ和分子层(marginal zone，MZ)内；22～24周时皮层、髓质、IZ、SVZ和VZ最内层均有GFAP阳性细胞，髓质中的GFAP阳性细胞免疫反应强烈，胞体浓染，突起围绕胞体向四周伸展，具有典型纤维型星形胶质细胞的特征；32～36周时GFAP阳性细胞的分布模式类似于22～24周，髓质中的阳性细胞数量增加。②在海马，9～16周期间GFAP免疫反应程度较弱，主要分布在海马伞、VZ和MZ；22周后GFAP免疫反应程度增强，数量增多，分布范围逐渐扩大。③实验各组额叶VZ、SVZ以及海马的海马伞、VZ均有GFAP和nestin免疫荧光双标阳性细胞存在。结论在人胚胎发育后期端脑星形胶质出现并逐渐增多、分布广泛并趋于成熟。

胶质纤维酸性蛋白；星形胶质细胞；额叶；海马；人类胚胎

神经元是神经系统的主要细胞，它们在信息传递中起着重要作用。同时，在结构上它们被大量神经胶质包绕，依赖并与胶质细胞相互作用。因此，胶质细胞发生是除神经细胞发生外另一个同等重要的研究领域。以往研究认为，在哺乳动物神经系统发育过程中，神经元主要在胚胎期生成，而多数胶质细胞则在出生后产生［1］。在大、小鼠的大脑皮质，神经发生开始于E12，高峰位于E15，持续到出生前后［2］；然而对于神经胶质，除过放射状胶质细胞在胚胎早期出现以外，大胶质细胞在胚胎发育的中期才开始出现，且维持在较低水平［3-4］。

星形胶质细胞是神经胶质的最主要细胞，其在小鼠E16的大脑皮质中才首次出现，高峰位于生后1个月［5-6］。病理方面的研究显示，星形胶质细胞的发育异常参与了许多儿童或成年疾病(唐氏综合症、神经抑郁症)的神经症状表现［7-9］。CHOI等［10］对8～20周人胚胎脑组织进行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫组化染色，对GFAP阳性星形胶质细胞出现的时间，与血管的关系以及室管膜及室管膜下区辐射状阳性纤维的分布进行了观察研究。国内邓晓林等［11］也对人胎儿中枢神经系统内GFAP阳性细胞的分布、形态等进行了较详细的观察。GFAP虽然是成熟星形胶质细胞的标志蛋白，但后续的研究发现，神经干细胞及神经前体细胞/胶质前体细胞也有不同程度的GFAP表达。因此，胚胎发育阶段的GFAP阳性细胞不全是成熟的星形胶质细胞［12-15］。为此，本研究采用GFAP单克隆抗体的免疫组织化学染色及GFAP与nestin(神经干细胞和前体细胞的标记蛋白)免疫荧光双标技术，对9～36周的胎儿大脑皮质、脑室区/脑室下区，以及海马内的星形胶质细胞出现时间、分布及形态特征进行研究，以期为人类神经系统胶质细胞的发育提供更丰富的资料。

1 材料与方法

1.1 胚胎脑收集研究所用引产的人胚胎标本共45例，均经引产孕妇本人或家属知情并同意后获取标本，整个后续的操作过程符合西安交通大学道德伦理委员会的章程和规定。经筛选后获得34例标本，参考孕妇的末次月经时间和B超检查结果，测量頂臀长，按Patten法推测胎龄。标本按胎龄(周)分布如下：9(n=2)，10(n=4)，11(n=3)，14(n=3)，15(n=3)，16(n=4)，22 (n=5)，24(n=4)，32(n=4)，36(n=2)。

1.2 标本分组依据胚胎发育的时间段，所收集来的胚胎按胎龄分为4组：9～11周(9例)，14～16周(10例)，22～24周(9例)和32～36周(6例)。

1.3 脑组织处理将胎儿标本置于冰上，开颅取脑。然后用冰的PBS冲洗脑表面，沿纵裂将大脑分成左、右两半，并用尖镊子小心剥离软脑膜，撕出脉络丛。直接切取额叶皮质、侧脑室前角周围脑组织和海马，组织块小于1 cm×1 cm×1 cm，根据组织块大小固定5 d左右。组织块经流水冲洗后，置于300 g/L的蔗糖-PBS溶液中，直至组织沉底。然后进行冠状位连续冰冻切片，片厚20μm。

1.4 切片染色免疫组织化学染色采用常规方法，一抗GFAP(小鼠，Neo Markers)，工作浓度为1∶200，4℃过夜孵育。生物素标记的小鼠IgG(Vector)1∶200，室温孵育1 h；ABC复合物(Vector)临用前1 h配置，室温孵育30 min；DAB显色盒购自北京中衫生物公司，临用前配置，显色5 min。免疫荧光双标染色的一抗为GFAP(小鼠，Neo Markers)和nestin(兔，Chemicon)，两种一抗混合，工作浓度均为1∶200，4℃过夜孵育。荧光二抗中先加入TRITC标记的小鼠IgG (北京中衫，工作浓度为1∶200)室温避光孵育3 h；然后加入FITC标记的兔IgG(北京中衫，工作浓度为1∶200)，室温避光孵育3 h；加入细胞核染料DAPI，室温避光作用5 min。阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤相同。

1.5 图像采集在显微镜(BX51，Olympus)下选取目标区域，保持光源亮度不变，白平衡后进行拍照。荧光染色切片在荧光显微镜下采集，黑平衡后照像。

2 结 果

2.1 额叶皮层及VZ/SVZ内的GFAP阳性细胞的发育性变化GFAP在成熟的星形胶质细胞和神经祖细胞中都有表达。在人胎9～11周期间，GFAP免疫阳性细胞主要位于VZ、SVZ和IZ内，免疫反应程度VZ内最强，胞体位于VZ最内层，阳性突起伸向SVZ(图1A、B)。从细胞形态和表达的位置判断，此时的GFAP阳性细胞主要为神经干细胞/祖细胞。14～16周时，GFAP阳性细胞存在于VZ最内层、IZ和MZ内，免疫反应程度较弱，且无典型星形胶质细胞的形态，可能仍为神经干细胞/前体细胞(图1C、D)。

在22～24周阶段，皮层中的GFAP阳性细胞突起较长，平行伸向内、外，细胞类型不能确定(图1 E)。髓质中的GFAP阳性细胞免疫反应最强烈，细胞清晰，胞体浓染，突起围绕胞体向四周伸展，还可见一些阳性细胞的突起延伸到微血管周围，包绕血管壁形成血管足，这些为典型的纤维型星形胶质细胞(图1 F)。VZ最内层、SVZ和IZ内有反应程度较强的GFAP阳性细胞，VZ和SVZ内的阳性细胞可能为神经干细胞，而IZ内的阳性细胞可能为星形胶质细胞(图1 G)。

32～36周时，GFAP阳性细胞在髓质和皮层中都有分布，皮层中星形胶质细胞数量较少，免疫反应较弱，在分子层表面可见一些阳性细胞，突起细长，有的伸向皮质深层(图1 H)；髓质中的星形胶质细胞均匀、散在分布，胞体浓染，突起较多，向四周伸展(图1 I)。VZ和SVZ内均有中等程度免疫反应的GFAP阳性细胞，从细胞形态判断，既有神经干细胞/祖细胞又有成熟的星形胶质细胞(图1 J)。

图1 不同发育阶段额叶皮质、VZ/SVZ内的GFAP阳性细胞（免疫组织化学染色）Fig.1 GFAP-positive cells in the frontal cortex，VZ/SVZ of human fetus at different stages(staining by immunohistochemistry，×400)

2.2 海马中GFAP阳性细胞的发育性变化从9～36周，GFAP免疫反应程度愈来愈强。在9～11周时，GFAP免疫反应强度较弱，阳性细胞主要位于将来形成海马伞的部位、MZ以及VZ，阳性细胞圆形或卵圆形，密集，突起短小(图2A、B)。14～16周时，GFAP阳性细胞的分布类似于11周，只是海马伞内的阳性细胞距离增大，伸出多个较长的突起(图2C、D)。22～24周时，VZ和海马内的GFAP免疫反应呈强阳性，海马伞的细胞较分散，VZ的阳性细胞排列成行。海马始层也可见中等反应程度的阳性细胞，数量较少(图2E、F)。32～36周时，GFAP阳性细胞比24周时增多，主要位于海马伞、VZ和始层(图2G、H)。从GFAP阳性细胞的形态和位置来看，位于VZ的突起短小的阳性细胞可能是神经干细胞/祖细胞，而位于海马伞和始层的阳性细胞，胞体清楚，突起较长，为典型的星形胶质细胞。

图2 人胎海马中GFAP阳性细胞的发育性表达（免疫组织化学染色）Fig.2 The developmental expression of GFAP-positive cells in the hippocampus of human fetus(staining by immunohistochemistry，×400)

2.3 GFAP和nestin免疫双标染色结果的变化nestin和GFAP共表达的细胞可能是某一特殊阶段的神经干细胞/前体细胞。9～11周时，双标阳性细胞主要分布在VZ和SVZ，而皮层中有少量双标阳性细胞(图3A、B)。16周时双标阳性细胞不仅位于VZ和SVZ，而且IZ内也发现较多的双标阳性细胞。随着发育的进行，VZ和SVZ中双标阳性细胞逐渐减少，到32周时，VZ、SVZ及MZ中仍有少量双标阳性细胞，而髓质中无双标阳性细胞(图3C～E)。

图3 不同发育阶段额叶内nestin（绿）和GFAP（红）免疫荧光双标染色结果Fig.3 Double-labeling immunofluorescence of nestin(green)and GFAP(red)in the frontal cortex of human fetus at different development stages

nestin和GFAP双标阳性细胞在海马发育中主要位于海马伞区域，特别是海马伞区的VZ，在14～16周的海马伞分布最多，而海马伞以外的其他海马各区很少见到双标阳性细胞。此后，随着发育进行，双标阳性细胞在海马伞的数量逐渐减少。

3 讨 论

在本研究中，GFAP被作为免疫反应的标志蛋白用来显示星形胶质细胞，由于神经干细胞以及神经祖细胞分化的早期阶段也表达GFAP，因此，为星形胶质细胞的判定增加了一定困难。在研究中，阳性细胞的形态和表达部位可作为依据，用于判断阳性细胞是神经祖细胞还是星形胶质细胞。另一方面，为了更好区分成熟的星形胶质细胞和神经干细胞/祖细胞，本研究还对不同发育阶段的皮质和海马进行了nestin和GFAP双标染色。作者认为双标阳性细胞应为神经干细胞或神经祖细胞，而单纯GFAP阳性的细胞即为成熟的星形胶质细胞。也有研究认为，神经干细胞/祖细胞表达GFAP-ð，而星形胶质细胞表达GFAP-α；此外，GFAP阳性的神经干细胞缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达，而星形胶质细胞同时表达GFAP、GS和谷氨酸-胱氨酸转运体(GLAST)，这可能会成为区别GFAP免疫阳性细胞类型的理想方法［16-17］。

本研究发现，16周前的皮层，GFAP主要表达在VZ和SVZ，细胞形态类似于nestin阳性细胞，双标染色显示GFAP阳性细胞全部表达nestin。因此，我们认为，16周前的GFAP阳性细胞主要为神经干细胞/祖细胞，也就是说16周前很少有成熟的星形胶质细胞出现。24周后，GFAP阳性细胞主要位于白质中，胞体较大，胞质浓染，突起细长，还可见有些细胞的突起伸向脑内微血管的周围，形成血管足包绕血管。VZ和SVZ内GFAP阳性细胞类似于nestin阳性细胞，皮质板和分子层中的GFAP阳性细胞数量较少，多分布在皮层表面，有些突起细长，平行伸向内、外。双标染色显示24周后，VZ、SVZ内GFAP和nestin几乎全部共存于同一个细胞，分子层表面也有一些两者共存的细胞，而在白质，GFAP阳性细胞和nestin阳性细胞相间存在，无双标阳性细胞。在海马，随着发育进行，GFAP免疫反应逐渐增强，阳性细胞也逐渐增多。不同于皮质的是，16周前海马的GFAP阳性细胞不在VZ，而主要位于海马伞原基和分子层，24周后海马伞部位的GFAP阳性细胞继续增多，VZ和始层逐渐出现GFAP阳性细胞，GFAP与nestin双标阳性细胞主要位于海马伞区域，特别是该区的VZ，以16周为高峰，海马其他部位很少见到双标阳性细胞。

从本研究结果可以看出，人类大脑星形胶质细胞的生成主要发生在胚胎发育的后半段，这与在实验动物研究中的结论基本一致。部分研究认为人类中枢神经细胞中，星形胶质细胞在胚胎8～12周期间就已出现，这可能与他们单独以GFAP作为星形胶质细胞的标志蛋白有关［10-11，17］。TIU［18］采用3种星形胶质细胞的标志(GFAP、S100B和GLT-1)研究了人胚胎14周后大脑皮质星形胶质细胞的发育性变化，发现14周时，皮层下仅有少量的GFAP阳性的星形胶质细胞，21周后才明显增多，本研究结果与上述发现基本一致。同时本研究发现，虽然某些神经干细胞/祖细胞表达GFAP，但是其表达量明显低于nestin的表达量。因此，我们推测在神经干细胞增殖分化过程中，nestin的表达时段长于GFAP表达时段是其可能的原因。

总而言之，在人胎脑发育过程中，星形胶质细胞的出现和成熟位于胚胎发育的后半段，并持续到出生后；胚胎发育前半段出现的GFAP和nestin双标阳性细胞可能为神经干细胞或神经祖细胞，而在后半段出现在白质和皮层中的GFAP阳性细胞才可能为真正成熟的星形胶质细胞。因此，GFAP不宜单独作为标志蛋白用于鉴定成熟星形胶质细胞，结合其他标志蛋白或方法综合判定星形胶质细胞或许更具说服力。

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(编辑 国 荣)

Developmental distribution of astrocytes in the frontal cortex and hippocampus of human fetuses

YANG Peng-bo1，ZHANG Jun-feng2，ZHANG Jian-shui1，XU Xi2，XIAO Xin-li1，LIU Yong1
(1.Institute of Neurobiology，Department of Human Anatomy and Histo-embryology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；2.Department of Human Anatomy，Xi'an Medical College，Xi'an 710021，China)

ObjectiveTo investigate the distribution and morphological characteristics of astrocytes in the frontal cortex，ventricular zone(VZ)，subventricular zone(SVZ)and hippocampus in human fetuses.MethodsBased on gestational age，the collected fetuses were divided into four groups：9-11 weeks，14-16 weeks，22-24 weeks and 32-36 weeks.Then the brain blocks from the frontal lobe，VZ/SVZ and hippocampus were cut out，fixed and made into frozen slices.Immunohistochemistry was used to observe the distribution and morphology of GFAP-positive cells.Furthermore，the immunofluorescence double-labeling of GFAP and nestin was used to remove GFAP-positive neural stem cells.Results①In the frontal cortex，GFAP-positive cells were mainly located in VZ/SVZ and intermediate zone(IZ)during 9-11 weeks；the innermost part of VZ，IZ and marginal zone(MZ) at 14-16 weeks.During 22-24 weeks，GFAP-positive cells could be detected in all layers including the cortex plate，medulla，SVZ and the innermost part of VZ.The strongly immunoreactive cells，with typical morphological features of fibrous astrocyte such as intensively staining cell bodies and many slender processes，were found in themedulla.An almost same distribution pattern of GFAP-positive cells at 22-24 weeks was found during 32-36 weeks except that the number of positive cells in the medulla was greater than that at 22-24 weeks.②In the hippocampus，the weak immunoreactivity was found in fimbira，VZ and MZ during 9-16 weeks；after 22 weeks，not only the immunoreactivity became strong and the distribution range extended，but also the number of positive cells increased gradually.③Double-labeling cells of GFAP and nestin could be detected in VZ，SVZ of the frontal cortex and VZ as well as in fimbria of the hippocampus in all groups.ConclusionDuring the later half of gestational age，astrocytes in human telencephalon appear and then gradually increase in number.At the same time，the astrocytes are widely distributed in the telencephalon and reach maturity in morphology progressively.

glial fibrillary acidic protein(GFAP)；astrocyte；frontal cortex；hippocampus；human fetus

R321

A

1671-8259(2014)05-0576-05

10.7652/jdyxb201405002

2014-02-28

2014-04-08

国家自然科学基金资助项目(No.81301041，81371348)，中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(No.xjj201122)以及陕西省教育厅科研基金资助项目(No.2013JK0756) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81301041，81371348)，the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.xjj201122)，and Research Project of the Department of Education of Shaanxi Province(No.2013JK0756)通讯作者：刘勇，教授，博士生导师.E-mail：liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

杨蓬勃(1974-)，男(汉族)，博士.研究方向：神经系统发育、损伤与修复.E-mail：yangpengbo74@126.com

时间：2014-07-22 16∶15 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1615.003.html