PM2.5对L02肝细胞部分癌基因和凋亡相关基因表达的影响

秦双建 ，李柏茹 ，蔡 颖，郑 凯，王冰玉，李闰冰 ，肖 芳，曾 明，*，徐新云*

(1．中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙410078；2．深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518055；3．南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

当前环境污染问题备受关注，相关研究证实，许多疾病的发生与空气污染有着密切联系[1]。大量流行病学、毒理学资料表明，大气细颗粒物(particulate matter，PM2.5)作为空气污染的主要有害成分，能引发呼吸系统炎症甚至导致心血管系统疾病、免疫系统疾病，进而诱发各类癌症，对人类的健康造成巨大威胁[2-4]。PM2.5的成分中大多包含多环芳烃、重金属离子等多种具有致突变性和致癌性物质[5-7]。人群吸入PM2.5后，它不仅能在肺泡沉积或进入血液循环，甚至可经过肺换气到达其他器官，进而导致肺外器官的损害：最终损害人体健康[8]。已有研究表明，PM2.5对肺和支气管细胞具有明显的致癌致突变作用[9-12]。PM2.5对于肝脏这一主要的解毒代谢器官有直接而深远的影响。多项研究表明，暴露于PM2.5可诱导肝脏的脂质堆积、氧化应激、胰岛素抵抗和炎症反应等[13-14]。目前大量的研究表明PM2.5对肝脏各方面具有危害，因此研究PM2.5对肝细胞是否存在致癌致突变作用，具有一定的理论意义。本文采用不同剂量PM2.5对人正常L02肝细胞进行染毒，检测癌基因(c-myc、c-fos、p53)和凋亡相关基因(Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2)在mRNA和蛋白水平的表达变化，为深入探讨PM2.5致癌致突变机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

L02细胞购于中国上海细胞库；RPMI 1640培养基、胎牛血清与0.25%Trpsin-EDTA购于美国Gibco公司；DMSO和K2CrO4购于美国Sigma公司；GAPDH、c-myc、c-fos、p53、Caspase-3、Caspase-8及Bcl-2基因PCR引物由上海生工合成；SYBR PrimeScript RT-PCR kit、 PrimeScrip RT reagent kit购 于 日 本TaKaRa公司；p53抗体(2527S)、c-myc抗体(9402S)购于美国Cell Signaling公司；c-fos抗体(SC-166940)、Caspase-3 抗体(SC-7272)、Caspase-8 抗体(SC-81656)、Bcl-2抗体(SC-7382)、β-actin抗体(SC-47778)购于美国Santa Cruz公司；二抗(羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP)购于美国Thermo Scientific公司；BCA垂直电泳系统(Mini-protean Tetra)购自美国Bio-Rad公司；7500实时荧光定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司；冷CCD成像系统购于美国GE公司；中流量大气采样器(TH-150CⅢ型)购自武汉市天虹仪器有限责任公司。

1.2 PM2.5采集和样品制备

PM2.5样品采集地点于山西太原，将直径为80 mm的石英滤膜装于中型流量采样器，按100 L/min的流量，每天24 h，连续多天采样并收集滤膜。将收集的滤膜剪成2 cm×2 cm大小于烧杯中，加入超纯水致浸没，用锡纸密封烧杯口，超声振荡30～40 min，留取PM2.5悬液，冷却至室温后装入特定容器中，锡箔纸密封，放入-80℃冰箱冷冻24 h，取出，放在真空冷冻干燥机至完全干燥；最后放入超净台中照紫外灯1～2 h，加入灭菌水制备成PM2.5样品混悬液，-20℃保存待用，使用前振荡混匀。

1.3 细胞培养与染毒

L02细胞培养于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中，经细胞消化，以4.5×105/mL的细胞浓度接种到6孔板，每孔加2 mL无FBS的RPMI 1640培养基，待细胞汇合度为70%～80%时进行PM2.5悬液染毒处理。根据课题组前期进行的CCK-8细胞毒性实验，本实验设阴性对照组即不做处理的L02细胞、PM2.5悬液染毒的终浓度分别为10、50 μg/mL，以10 μmol/L的K2CrO4(以下用Cr6+表示)水溶液为阳性对照组，PM2.5混悬液染毒组和阳性对照组细胞均染毒24 h。

1.4 目的基因mRNA表达水平的实时荧光定量聚合酶链式反应检测

PM2.5染毒L02细胞后，提取L02细胞总RNA并反转录合成cDNA，按照试剂盒说明书操作。反转录条件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、10 min，-20℃冰箱保存cDNA样品。取各组细胞的cDNA 0.4 μL为模板进行实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qPCR)，检测目的基因c-myc、c-fos、p53、Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2的表达。qPCR反应条件：95℃预变性30 s，共1个循环；95℃变性5 s，56℃退火延伸30 s，共40个循环；以GAPDH的CT值为内参，采用2-ΔΔCT计算各基因的相对表达量。目的基因PCR引物见表1。

表1 目的基因PCR引物序列

1.5 Western blot检测目的蛋白表达水平

PM2.5染毒L02细胞结束后，吸取残余培养基，用冷的PBS洗3遍，加入细胞裂解液，置于摇床上，冰上裂解30 min，并用细胞刮刷快速将裂解好的细胞刮落，收集细胞至2 mL EP管中，12 000 r/min，4℃离心25 min。加入5×SDS-PAGE，100℃变性10 min，参照 BCA法进行蛋白定量，样品置于-20℃保存待用。配置10%的分离胶和5%的浓缩胶，每个样品按等体积上样，两边的孔加入预染蛋白质marker作为相对分子质量对照，恒压按80 V、35 min，120 V、40 min条件至电泳结束。随后200 mA恒流转膜90 min，再用5%的脱脂奶粉室温下在摇床上封闭1.5 h。根据目的蛋白的大小，切取相应的条带，配制一抗稀释液，冰上孵育过夜；1×TBST缓冲液洗4次：每次10 min。按1∶5 000比例稀释HPR标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗，室温下孵育1 h；1×TBST缓冲液洗3次，每次10 min。加入ECL化学发光试剂后用冷CCD成像系统对其进行曝光拍照，所得图像用Image J软件进行条带灰度值分析。

1.6 统计分析

实验数据以均值±标准差表示，所有实验重复3次；应用SPSS 22.0进行统计学分析，各组间(PM2.5混悬液染毒组、阳性对照组与阴性对照组)mRNA、蛋白表达水平指标间差异的分析采用单因素方差分析：LSD法进行两两比较，以α=0.05为检测水准。

2 结果

2.1 PM2.5染毒后癌基因和凋亡相关基因mRNA表达水平变化

qPCR实验的结果见图1。与阴性对照组比较：10 μg/mL和50 μg/mL PM2.5混悬液染毒组以及阳性对照Cr6+组，c-myc mRNA表达水平分别升高69.5%、118.0%、51.1%；c-fos mRNA表达水平分别升高50.3%、64.4%、23.3%；p53 mRNA表达水平分别下降4.0%、22.0%、18.0%；Caspase-3 mRNA表达分别升高31.0%、30.5%、42.0%；Caspase-8 mRNA表达分别升高25.3%、40.3%、64.5%；Bcl-2 mRNA表达分别降低40.5%、46.9%、41.4%，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 PM2.5染毒L02细胞目的蛋白表达水平变化

Western blot的检测结果见图2和图3。结果表明，与阴性对照组比较，c-myc蛋白在10、50 μg/mL PM2.5混悬液和Cr6+染毒后表达水平分别升高32.3%、49.3%、70.6%；c-fos蛋白表达水平分别升高11.3%、50.2%、45.2%；p53蛋白表达水平分别下降17.5%、40.0%、42.9%；Caspase-3蛋白表达水平分别升高23.1%、33.9%、43.1%；Caspase-8蛋白表达水平分别升高31.4%、52.1%、80.0%；Bcl-2蛋白表达量分别下降14.3%、23.3%，36.9%，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

3 讨论

图1 PM2.5染毒对L02细胞c-myc、c-fos、p53、Caspase-3、Caspase-8和Bcl-2 mRNA表达水平的影响

图2 PM2.5染毒对L02细胞c-myc、c-fos和p53蛋白表达水平的影响

图3 PM2.5染毒对L02细胞Caspase-3、Caspase-8和Bcl-2蛋白表达水平的影响

本文结果显示，L02细胞经阳性对照物Cr6+染毒后，c-myc、c-fos、Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表达均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，p53、Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平均明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。经PM2.5染毒处理后，PM2.510 μg/mL和50 μg/mL混悬液组引起 c-myc、c-fos、Caspase-3、Caspase-8 在mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)；p53、Bcl-2 mRNA和蛋白在PM2.510 μg/mL和50 μg/mL混悬液组中表达水平均明显下降(P＜0.05或P＜0.01)。这些结果提示大气PM2.5对L02细胞中促癌基因和凋亡相关基因表达具有明显促进作用，推测PM2.5致癌、致凋亡可能与通过促进癌基因和凋亡相关基因表达有关。

我国经济快速发展，严重的环境污染和癌症频发、高发等问题接踵而至[15]，而PM2.5常被用于评估空气污染的严重程度[16]。PM2.5的来源及组分很复杂，如果长期吸入PM2.5污染的空气，可造成人体多系统功能性和器质性的损伤。原癌基因是一种广泛存在于真核细胞、可经反转录病毒转导成为致癌活性的癌基因[17]。c-myc可通过调节致癌等相关基因的表达，参与恶性转化和肿瘤进展。每年约70 000例美国癌症死亡病例中发现了c-myc基因改变，其中包括肝细胞癌[18]。正常细胞中c-fos基因表达水平较低，而在炎症细胞中受炎症介质的刺激，引起c-fos基因快速表达[19]。正常情况下，p53蛋白是抑癌因子，调控生命活动的各个方面。Caspase-8与Caspase-3在Caspase级联反应中处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键步骤及传导的共同通路。Caspase-8与Caspase-3在已知的TRAIL/TRAIL-R介导的细胞凋亡途径中也同样起重要作用[20]。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调节中发挥着关键作用，且Bcl-2高表达时可明显抑制细胞凋亡。

目前大气污染与癌症发病存在密切联系，虽然现有大部分研究主要针对PM2.5与呼吸系统疾病，探讨PM2.5致癌分子机制，但由于PM2.5对人体多器官多系统都存在健康危害，因此本文采用PM2.5染毒L02细胞，开展PM2.5对L02肝细胞相关癌基因和凋亡相关基因表达影响的研究，结果表明PM2.5染毒引起L02肝细胞中促癌基因和促凋亡相关基因表达升高，抑癌基因和抑凋亡相关基因表达下降，提示PM2.5对L02肝细胞促凋亡相关基因和促癌基因具有一定的促进与激活作用。本研究结果对于今后进一步深入探讨PM2.5的健康危害，具有一定的理论意义和应用价值。