DEHP与DBP联合染毒对雌性大鼠糖代谢的影响

郭 琛，李丽萍，张亚娟，李 玲，德小明，刘贺荣，杨惠芳

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川 750004）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病率逐年上升，据国际糖尿病联盟（the international diabetes federation，IDF）数据显示，我国是全球糖尿病患者数量最多的国家[1]。作为一种内分泌干扰物—邻苯二甲酸酯类物质（phthalic acid esters，PAEs），又名增塑剂[2-3]，常作为添加剂添加到食品包装材料、儿童玩具等各种材料中，其主要作用是增加材料的可塑性和柔韧性[4]。邻苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）的使用量约占我国PAEs总使用量的50%，是使用量最高的一种增塑剂，其次是邻苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）[5-6]。研究表明[7-8]，PAEs有干扰内分泌系统环境雌激素的效应，糖尿病虽与遗传和生活方式有关，但环境内分泌干扰物的作用也不容忽视。研究[9-10]发现，PAEs对生殖异常、性别分化、神经发育和肿瘤等的发生有一定的影响，近年来PAEs对胰岛素抵抗、T2DM等慢性糖代谢紊乱疾病的研究成为热点。

在糖尿病发生发展过程中胰岛β细胞损伤和胰岛素抵抗发挥着重要作用[11]，有研究[12]表明，氧化应激导致胰岛β细胞凋亡是胰岛β细胞功能受损的主要原因，而长期低剂量暴露于PAEs可诱发体内过氧化物的聚集而引起损伤[13]。流行病学调查表明[14]，PAEs与胰岛素抵抗、T2DM间有一定的相关性，但有关实验研究相对较少，且人类在暴露过程中并非单一介质暴露。为此本研究采用DEHP、DBP以及二者联合染毒，观察对大鼠胰腺组织中凋亡蛋白的影响，以探讨DEHP、DBP以及二者联合染毒对T2DM的作用及其机制。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DEHP、DBP（国药集团化学试剂有限公司），玉米油（金龙鱼），血糖仪、血糖试纸（艾科灵睿，中国），大鼠胰岛素ELISA测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，中国），超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所，中国），Bax、Bcl-2、Caspase 9、Caspase 3兔抗大鼠一抗（Proteintech，美国），GAPDH内参（Bioss，中国），二抗山羊抗兔（中杉金桥，中国），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Invitrogen，美国），酶标仪（Bio-Rad，美国）。

1.2 实验动物

选择40只健康清洁级SD雌性大鼠，3周龄，体质量50～70 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（宁）2015-0001。饲养房间温度为（22±3）℃，相对湿度（60±5）%，通风良好，24 h昼夜循环光照条件下饲养，自由饮水、进食。

1.3 分组与处理

将大鼠随机分为4组，分别为对照（玉米油）组、DEHP染毒组（1/40 LD50，750 mg·kg-1）、DBP染毒组（1/40 LD50，500 mg·kg-1）和DEHP+DBP（750+500）mg·kg-1染毒组（联合染毒组），每组10只。将DEHP和DBP溶于玉米油，配制成所需浓度的溶液。每天根据大鼠的体质量计算大鼠的给药剂量，采用灌胃方式染毒，1次/d，每周5 d，连续染毒8周，之后观察和测定相关指标。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠一般状况、体质量 于染毒期间，每周称量大鼠体质量1次，并观察大鼠毛发、皮肤、精神状态以及行为方面有无变化。

1.4.2 器官系数的测定[15]于末次染毒过夜禁食12 h后先称大鼠体质量，后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，心尖取血后处死，将血液样本置于低温离心机中离心15 min（3 500 r·min-1）后取上清，保存于-80℃待测；同时取出胰腺，将其放在生理盐水中冲洗，在滤纸上拭干后称量湿重。器官系数（%）=器官质量/体质量×100%。

1.4.3 大鼠空腹血糖、胰岛素水平测定、胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）和敏感指数计算 大鼠末次染毒后禁食（不禁水）至少12 h将大鼠剪尾，用血糖仪检测大鼠空腹血糖；采用ELISA法检测大鼠血清空腹胰岛素水平，严格按照试剂盒规范进行。并计算稳态模型HOMA-IR和胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，ISI）[16]。HOMA-IR=空腹胰岛素（mIU·L-1）×［空腹血糖（mmol·L-1）/22.5］。ISI=1/Ln［空腹胰岛素（mU·L-1）×空腹血糖（mmol·L-1）］。

1.4.4 血清SOD活力和MDA含量测定 采用SOD、MDA试剂盒测定大鼠血清中SOD活力和MDA含量，严格按照说明书步骤进行操作。

1.4.5 Western blot法测定胰腺组织中Bax、Bcl-2、Caspase 9、Caspase 3蛋白表达水平 取约100 mg胰腺组织，置于冰上加入1 mL的组织裂解液匀浆，12 000 r·min-1，4℃离心10 min取上清，BCA法测定蛋白含量，根据不同分子质量选择相应浓度的SDS-PAGE凝胶，80 V稳定电压电泳（蛋白上样量为60μg），转膜条件采用0.22μm PVDF膜湿转，5%的脱脂牛奶（TBST溶液配制）封闭1.5 h后敷上不同浓度的一抗，4℃过夜，漂洗液清洗3次，二抗（1∶2 000）封闭1.5 h，漂洗液洗涤3次后在避光的条件下曝光，扫描图像后用Image J软件计算各条带的吸光度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠一般情况的影响

随着实验的进行，三组染毒组大鼠被毛无光泽、个别有少量脱毛现象，并在灌胃过程中出现烦躁抵触现象。

2.2 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠体质量的影响

各组大鼠体质量随染毒时间的延长而增加，不同时间各组大鼠体质量差异均无统计学意义（P均＞0.05），见图1。

图1 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠体质量的影响

2.3 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠胰腺质量及器官系数的影响

与对照组比较，DEHP、DBP单独染毒及DEHP+DBP联合染毒组雌性大鼠胰腺的质量和器官系数差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠胰腺质量及其器官系数的影响（±s）

表1 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠胰腺质量及其器官系数的影响（±s）

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2.4 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠空腹血糖、胰岛素水平、HOMA-IR、ISI指标的影响

染毒第8周末，各组大鼠空腹血糖差异均无统计学意义（P均＞0.05）。胰岛素水平、HOMA-IR和ISI各组差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与对照组相比，联合染毒组血清胰岛素浓度升高，HOMA-IR增加，ISI降低（P均＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平、HOMA-IR、ISI的比较（±s）

表2 各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平、HOMA-IR、ISI的比较（±s）

与对照组相比*P＜0.05。

组别 n 空腹血糖/（mmol·L-1） 胰岛素/（mIU·L-1） HOMA-IR ISI对照组 10 4.51±0.62 38.23±12.63 8.01±2.00 -2.01±0.26 DEHP组 10 4.82±0.41 38.92±5.40 8.42±1.73 -2.11±0.20联合染毒组 10 5.00±0.39 74.48±24.61* 16.05±5.38* -2.79±0.35*DBP组 10 4.66±0.32 38.62±19.63 8.26±4.71 -2.05±0.44 F值 1.408 5.887 6.880 6.447 P值 0.271 0.005 0.003 0.003

2.5 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠血清中SOD活力和MDA含量的影响

染毒8周后，与对照组相比，DEHP、DBP单独染毒和联合染毒组大鼠血清SOD活力下降、MDA含量升高（P均＜0.05），见图2。

图2 DEHP、DBP及联合染毒对雌性大鼠血浆氧化损伤指标的影响（n=10，±s）

2.6 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠胰腺组织中凋亡蛋白表达的影响

染毒8周后，与对照组相比，DEHP、DBP单独染毒和联合染毒组均使Bax、Caspase 9、Caspase 3蛋白表达水平增加，Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax的比值下降（P均＜0.05），见图3。

图3 DEHP、DBP及联合染毒对大鼠胰腺组织中凋亡蛋白表达的影响（n=3，±s）

3 讨论

研究发现，环境内分泌干扰物对人类健康造成多种危害，并且多数情况以多种物质混合的形式接触[17]，而作为最常见的内分泌干扰物的DEHP和DBP与代谢紊乱有关[18]。本次实验结果表明，DEHP、DBP以及联合染毒对雌性大鼠体质量增长、胰腺组织的质量和器官系数没有影响，提示在此剂量下和染毒期间内DEHP、DBP以及联合染毒对雌性大鼠体质量增长和胰腺组织无明显作用。T2DM主要表现为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损。本次研究结果显示，两种药物联合染毒后，胰岛素浓度、HOMA-IR增加，ISI降低，提示DEHP和DBP联合染毒可能会引起雌性大鼠发生胰岛素抵抗。研究[19]表明，在引起糖尿病的过程中起决定作用的是胰岛β细胞功能受损。氧化应激对于诱导β细胞功能异常至关重要。Tanaka等[20]研究表明，分离人胰岛和胰岛β细胞暴露于高葡萄糖浓度会导致细胞内过氧化物水平升高。正常细胞内的促氧化物和抗氧化物维持在平衡状态，有研究[21-22]表明DEHP、DBP可打破机体内氧化-抗氧化的平衡机制，进而使机体进入氧化应激状态。研究[22]发现，DEHP和DBP可诱发机体脂质过氧化水平增强，氧化应激水平增高，从而对机体造成危害。本次实验结果表明，DEHP、DBP单独染毒与两者药物联合染毒均可使SOD活力降低、MDA含量增加。

细胞凋亡是由多基因调控的，在生理或病理情况下细胞程序性死亡[23]。研究[24]表明在线粒体凋亡途径上促凋亡蛋白（如Bax等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2等）发挥着重要作用，而Bcl-2/Bax称为“凋亡开关”，决定细胞是否进入凋亡状态[25]。参与细胞凋亡的Caspase家族是一组存在于细胞质中的特异性半胱氨酸蛋白酶，其中凋亡的启动者是Caspase 9，凋亡的主要执行者是Caspase 3[26]。本次实验结果表明DEHP、DBP单独染毒与两者药物联合染毒可使Bax、Caspase 9、Caspase 3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达下降，Bcl-2/Bax比值下降。

综上所述，DEHP、DBP两种药物联合染毒可能降低SOD活力、增加MDA的含量使胰岛β细胞氧化应激水平增加，诱导胰岛β细胞凋亡。但此结论还需通过后续实验进一步的研究来加以证实。