医用臭氧治疗软组织损伤的研究进展

阮 珍，寇久社

（1.陕西中医药大学第二临床医学院，咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，咸阳 712000）

臭氧由3个氧原子组成，是一种不稳定分子。医用臭氧是以医用纯氧制备所得的臭氧-氧气混合气体。自第一次世界大战期间臭氧被用来治疗厌氧梭状芽胞杆菌感染以来，其在医学上的应用已有100多年。医用臭氧具有杀菌、抗炎、抗氧化、镇痛及免疫调节等作用[1]。在适当的浓度下臭氧是一种理想的药物。随着臭氧应用的不断发展及新型医用臭氧发生器的出现，臭氧浓度可被精确测定，且臭氧的生物学机制逐渐被阐明，其在临床上的应用越来越广泛，治疗效果也逐渐得到人们的认可。目前已广泛应用于骨科、皮肤科、妇科、口腔科、疼痛科等多个医学领域，对血管疾病、退行性疾病、口腔疾病、慢性感染、急慢性软组织损伤等多种疾病有着很好的疗效[2-6]，也可改善局部血液循环，改善组织缺氧、减轻脑水肿，用于脑卒中的辅助治疗[7]。臭氧为绿色医疗做出了极大贡献，目前，世界各地都在使用医用臭氧，臭氧疗法逐渐迈入正统医学。本文主要介绍医用臭氧治疗急慢性软组织损伤的现状及其可能的机制。

1 软组织损伤的概述

软组织损伤是由各种急性外伤、慢性劳损等原因造成的除骨骼外的各组织出现功能或者结构的异常，临床上常表现为疼痛、肿胀、畸形，严重者可累及肌肉、肌腱、关节等，造成运动功能障碍[8]。软组织损伤的就诊人数占临床相关科室的50%～80%[9]。急性软组织损伤包括扭伤、挫伤、强力拉伤等。慢性软组织损伤多由急性软组织损伤发展而来，是一种迁延难愈的慢性疾病，如腰肌劳损、韧带损伤等。急性损伤期，毛细血管破裂出血导致淤血、局部肿胀，肿胀压迫神经，产生疼痛，导致肌肉痉挛，血管收缩，组织缺血、缺氧、代谢产物蓄积，刺激末梢神经使疼痛进一步加剧[10]。损伤区域微循环改变及能量代谢障碍促使炎性单核细胞从循环中募集迁移至损伤部位分化为巨噬细胞，这些巨噬细胞在早期表现为促炎表型（M1型），分泌大量促炎因子，包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）和诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等，清除病原微生物及损伤组织，但其也可加强炎性反应，促进组织损伤。在急性炎症的晚期，M1型巨噬细胞发生凋亡或转换为抑炎表型（M2型），分泌IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，促进组织愈合[11-12]。另外，在疾病的发展过程中，局部组织释放大量5-羟色胺、前列腺素等致敏物质，造成局部神经损伤、组织挛缩变性。因此，早期减少炎症因子的释放、促使巨噬细胞转化为抑炎表型、改善微循环障碍、缓解疼痛症状等是软组织损伤治疗的关键。已有研究表明，臭氧具有抑制促炎因子TNFα、IL-6等的表达，刺激抑炎因子IL-10的释放，抑制前列腺、缓激肽等致痛物质的释放，增强局部血流灌注，提高局部氧浓度等作用，可有效应用于各种软组织损伤的治疗[3，13]。

2 医用臭氧在软组织损伤中的应用

对于软组织损伤，临床上暂无统一的治疗措施。臭氧治疗具有操作简单、价格低廉、不良反应少、患者容易接受等优势，是目前治疗软组织损伤安全有效的措施之一[14]。临床上，臭氧治疗已应用于各种急慢性软组织损伤，可有效减轻软组织损伤的疼痛，改善临床症状，治疗效果确切，应用浓度集中于30～40 mg·L-1。既往数据[15-16]分析表明，臭氧治疗的时间窗为10～80μg·mL-1。2018年臭氧治疗的共识中指出，臭氧软组织痛点注射推荐浓度不超过30 mg·L-1。

对急慢性软组织损伤、肩周炎等软组织炎性疾病，臭氧有消炎镇痛的效果，能显著改善症状，提高患者生活质量。经临床验证，将臭氧准确无误地注射浸润至病变相关位置，可使疗效达到最优，故准确地判断病变位置和病理类型非常重要，进行靶向注射确保臭氧浸润至病变组织，或根据患者的实际情况，结合其他治疗技术综合治疗以达到治疗的最佳效果，如臭氧联合小针刀治疗、臭氧联合针刺疗法、臭氧联合推拿治疗等[17-19]。联合治疗既可缩短疗程，又能减少臭氧的用量及浓度，保证了治疗安全性。臭氧的治疗呈剂量-效应关系，浓度低时效果欠佳，浓度过高时则具有一定的毒性。高浓度的臭氧会导致一些生物分子被氧化，丧失生物活性，不利于细胞生存[6]。有研究表明[20]，臭氧对肺组织有严重的损伤作用，这取决于其使用剂量及暴露时间。Oliviero等[3]共纳入6项随机对照实验，共353例患者，做了一项关于臭氧注射对膝关节炎患者疼痛和生理功能影响的系统评价，6项研究中均未发现严重不良事件。表明臭氧虽然有毒性作用，但控制在适当浓度及剂量下可避免毒性，产生良好的治疗作用，且极少发生不良反应，安全性高。

3 医用臭氧治疗软组织损伤的可能机制

3.1 医用臭氧可促进组织再生

医用臭氧具有促进组织再生的作用。在一项纳入了9项临床研究的Meta分析结果中[21]显示：臭氧局部注射治疗慢性创伤（包括糖尿病溃疡、动静脉瘘、枪伤和慢性烧伤等），可有效促进伤口愈合。Leroy等[22]的研究表明，暴露0.5μg·mL-1臭氧可显著增加伤口愈合过程中各种基因的表达。动物实验证明[23]，臭氧油的局部应用可使α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和TGF-β1等基因作用增强，通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增加成纤维细胞的活化和迁移，从而促进创面愈合。臭氧治疗对小鼠肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，可减少促炎因子的释放（IL-6、TNF-α等），并促进肝脏组织的再生[24]。Zhang等[25]采用标准治疗加臭氧的套袋疗法治疗糖尿病足，患者伤口渗出液中VEGF、TGF-β及血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）水平明显增高。VEGF促血管内皮细胞生长，是血管形成的重要因子；TGF-β可促进伤口愈合，在骨骼肌再生修复中起关键作用[26]；PDGF可以促进细胞增殖，并参与毛细血管的生成，修复微循环，加速组织损伤修复。这些因子的改变表明臭氧可有效促进创面组织的修复。另外，臭氧治疗既可以触发氧化应激，又可抑制氧化应激，调控氧化应激处于对机体有利的水平。研究显示[15]，机体每毫升血液中存在20～40μg的臭氧就会触发氧化应激，激活多种生物学过程。而在用臭氧自血疗法治疗纤维肌痛症患者的实验中发现，臭氧可以降低外周血单核细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）、脂质过氧化物（lipid peroxidation，LP）和蛋白质羰基（protein carbonyl，PC）的含量，轻度降低氧化应激水平，改善患者的症状[27]。中度氧化应激可激活核因子-E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor-2，Nrf2），诱导抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）的转录[28]。Nrf2靶向基因具有细胞保护功能，并可抑制促炎基因的诱导，在炎症介导的疾病中起保护作用[29]。臭氧能够上调内皮细胞中血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表达，HO-1可调控炎性反应及Nrf2/ARE通路，HO-1还可调节NF-κB通路，降低促炎细胞因子表达，诱导抗炎细胞因子释放[30-31]。中度的氧化应激还可诱导缺氧诱导因子-α（hypoxia inducible factor-α，HIF-α）的产生，HIF-α调控缺氧诱导的信号通路，可提高机体对慢性缺氧的耐受能力，增加VEGF的产生，促进新生血管的生成，HIF-α还可以正向调节造血干细胞的形成，促进组织修复过程[32]。中度氧化应激还能增强组织细胞抗氧化和抗自由基的能力，在面神经损伤的大鼠模型中，臭氧可改善自由基对神经的损伤，促进面神经的再生[33]。此外，低臭氧浓度可促进脂肪来源的成人干细胞（human adiposederived adults stem cells，hADAS）的脂肪生成，而脂类作为信号因子在调节新陈代谢及细胞修复中起着关键作用[34]。TNF-α可致细胞凋亡，抑制组织再生。Hao等[35]在切除尾鳍的斑马鱼模型中，观察到臭氧水可促进尾鳍的再生，并发现臭氧对TNF-α具有双重调控作用，损伤早期臭氧促进TNF-α的表达，有利于清除坏死组织，后期抑制TNF-α的表达，促进组织再生。

3.2 医用臭氧的抗炎作用

软组织损伤时，炎症因子贯穿始终。组织损伤早期促炎因子释放，晚期出现抗炎因子。观察创伤性前交叉韧带撕裂患者的滑膜液，早期炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平显著增高，晚期滑膜液中IL-10、IL-4的水平增高，对软骨细胞起到保护作用[35]。而这些因子的来源可能是滑膜巨噬细胞、成纤维细胞和软骨细胞[36]。有研究[1]显示，3%和5%臭氧关节腔注射治疗类风湿性关节炎，可减少促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表达，且不会产生任何毒性或严重的副反应。寇久社等[37-38]的研究表明，臭氧治疗可明显降低兔骨骼肌损伤后损伤组织及血浆中IL-6及TNF-α等炎症因子的释放，减轻组织变性。Yıldırım等[39]制备了大鼠软组织损伤模型，将大鼠随机分为3组，臭氧治疗组、高压氧治疗组、对照组，干预后结果显示，臭氧治疗组iNOS明显下降，HIF-1、HO-1等明显上升，臭氧治疗组水肿在治疗第1天即明显缓解，表明臭氧治疗明显减轻了软组织损伤的炎性反应，改善了缺氧及微循环障碍。臭氧抗炎作用的机制可总结为：1）减少促炎因子的释放，如IL-1β、IL-6以及TNF-α等；2）抑制NF-κB的活化：TNF-α可激活NF-κB途径，导致下游其他促炎细胞因子的级联反应，形成恶性循环，臭氧治疗可抑制TNF-α释放，从而抑制NF-κB的活化；3）可通过调节氧化-抗氧化的平衡，中和反应性氧化产物发挥抗炎作用[40]。

3.3 改善组织缺血缺氧状态

软组织损伤早期，组织的氧需求量增加为平时的20倍左右[39]，臭氧治疗可改变机体组织的缺氧状态，其可能机制：1）臭氧增加红细胞的糖酵解率和2、3-二磷酸甘油酸，使氧血红蛋白曲线向右移动，增加对机体组织的供氧[41]；2）改善血液流变学，降低血液黏度；3）臭氧易溶于血液和组织液，分解为单氧，使氧分压增高；4）臭氧与组织液相互作用产生脂质氧化产物（lipid oxidation products，LOPs），LOPs可激活内皮细胞，引起前列环素、IL-8和一氧化氮（NO）等的释放。IL-8是一种促炎因子，可趋化中性粒细胞至损伤组织，激活巨噬细胞等炎性细胞，促进早期组织修复，NO可刺激缺血性血管部位的血管舒张，进而减轻组织充血水肿，增加组织供氧[13]；5）组织缺氧刺激HIF-α的表达，从而升高VEGF的水平，促进新生血管的形成；6）臭氧衰变后，可直接向局部病灶组织供氧，改善缺氧，促进修复；7）臭氧治疗时，可诱导超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等酶的作用，使线粒体呼吸链中的氧气利用更加有效；8）H2O2是臭氧发挥治疗作用的主要活性氧分子[39]，H2O2可以改变血小板的聚集方式，抑制血栓的形成；可激活红细胞中的戊糖循环，增加NADPH的生成，维持红细胞膜的完整性[15]。

3.4 医用臭氧的镇痛作用

软组织损伤的主要临床表现为疼痛，臭氧可显著改善疼痛症状。臭氧镇痛机制可能如下：1）刺激中间神经元释放脑啡肽等物质[42]；2）可直接作用于病灶周围神经末梢；3）抑制前列腺素、缓激肽及致痛物质（P物质、磷脂酶A2等）的释放；4）局部注射可使抗氧化酶过度表达，清除氧自由基而发挥镇痛作用；5）减少炎症因子的释放。臭氧不仅对各种急慢性软组织损伤所致的疼痛有效，也可减轻各种原因所导致的神经病理性疼痛、炎性疼痛、癌性疼痛等[43-44]。

此外，关节软骨损伤与软骨细胞自噬缺陷相关，臭氧可促进软骨细胞自噬，改善软骨细胞活力，减轻软骨细胞损伤[45]。臭氧还具有免疫激活和免疫调节作用，可使血液中免疫细胞的数量和活性增加（主要为T淋巴细胞），增加白细胞数量，增强巨噬细胞吞噬能力。另外，臭氧还可氧化分解机体产生的废物及毒性物质，促进有害物质排出体外。

综上所述，臭氧对于各种软组织损伤疾病的治疗效果显著，不会有病灶周围结构损伤等并发症的存在，医疗消耗少、绿色安全，可单独应用也可与其他治疗手段联合应用，联合应用还可减少其他治疗的副反应。目前可以根据患者的具体情况采用臭氧的不同治疗方式，如臭氧局部注射、臭氧水的静脉输注、冲洗、直肠灌注、大自血疗法、局部臭氧罩及臭氧油的应用等，充分发挥臭氧的治疗作用。新型医用臭氧发生器能够准确控制臭氧使用剂量，臭氧将成为多种疾病安全有效的治疗选择。但研究[46]表明，长期暴露于低浓度的臭氧，正常及肿瘤培养的细胞都会发生变化，导致细胞死亡和功能消失，对肺组织会产生损害，也可能会导致一些慢性炎症，加之目前臭氧治疗软组织损伤的确切机制尚不明确，阻碍了其在临床中的广泛应用，故确定臭氧的最佳给药剂量和给药频率，探索臭氧治疗的作用机制为未来臭氧的临床应用提供理论基础尤为重要。软组织损伤早期，多种促炎症因子（IL-1β、IL-6以及TNF-α等）释放，加重损伤；损伤晚期大量生长因子（PDGF、VEGF、TGF-β）等水平增加，调节组织再生，促进细胞增殖和血管生成，改善局部缺氧，促进组织修复[47]，这些促炎及抗炎因子可能由不同类型的巨噬细胞产生，而臭氧治疗可调控这些因子的表达，臭氧是否是通过影响巨噬细胞来调控这些因子的表达以达到治疗目的，仍有待进一步研究。