生酮饮食对人肺癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响

张 凡，刘广超，张之晗，刘方芳，谢 琪，高淑清，*

（1．河北医科大学第四医院营养科，河北石家庄 050011；2．中国人民解放军联勤保障部队第980医院普通外科，河北 石家庄050011)

正常细胞在有氧条件下通过线粒体氧化磷酸化代谢产能，而肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下仍表现出较高的糖酵解速率，这种从氧化磷酸化到糖酵解的转变称为“Warburg效应”或“有氧糖酵解”[1]。肿瘤细胞生长、繁殖速度快，而糖酵解产能特点为低效高速，采用糖酵解可以快速代谢更多的葡萄糖，合成大量ATP以满足其生长需求。Warburg观察到肿瘤细胞消耗的葡萄糖约为正常细胞的200倍，对于肿瘤细胞来说，它比正常细胞对葡萄糖的缺乏更敏感[2-3]。由于肿瘤细胞的这种特性，我们考虑可以采取降低饮食中碳水化合物的方式，这种饮食方式称为生酮饮食(ketogenic diets，KD)。KD是由高比例脂肪、极低碳水化合物和适量蛋白质组成的一种饮食方案，它可以选择性切断肿瘤细胞的能量供应，干预其生存的环境，从而可以达到抑制肿瘤生长的目的。研究发现，肿瘤细胞线粒体电子传输链功能失调，导致活性氧产生增多。为了维持细胞内氧化还原的平衡，肿瘤细胞需要通过启动抗氧化系统清除过量的活性氧。但是，当细胞内活性氧增多超出临界水平或抗氧化系统受到抑制时，这种氧化还原平衡状态就会被打破，造成细胞氧化损伤，导致发生坏死或凋亡。氧化应激是一种氧化还原失衡状态，通过升高活性氧的水平或者抑制细胞抗氧化能力的方法能够进一步加重氧化应激，可以成为肿瘤治疗的一个途径。4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)是氧化应激的重要标志物，机体氧化应激水平升高时ROS产生增多，导致细胞膜上ω-6多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，最终使4-HNE的表达量增多[4]。有文献指出生酮饮食抗肿瘤机制可能与AMPK/mTOR信号通路的激活有关，但是生酮饮食是否会通过增强肿瘤细胞的氧化应激抑制肿瘤细胞的生长，目前国内还未见相关报道[5-6]。近几年KD在肿瘤动物模型上取得不错的效果，但是临床应用的报道却很少，所以进一步完善KD抑制肿瘤生长的机制是当前亟须解决的问题。本研究通过建立A549人肺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，分别给予标准饲料和生酮饲料喂养，观察KD对裸鼠皮下移植瘤生长的影响，并探讨KD抑制肿瘤生长的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验动物

人肺腺癌细胞系A549购自中国科学院干细胞库。SPF级雌性BALB/c裸鼠购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，4周龄，体质量14～15 g，实验动物合格证号No.1100111911036198，共10只。所有动物实验均经过河北医科大学第四医院动物保护委员会批准，并严格按照实验动物相关规定进行各项操作。

1.2 主要材料与仪器

DMEM培养基、PBS缓冲溶液、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素双抗购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗人4-HNE抗体购自美国Abcam公司；标准饲料购自北京市华阜康生物科技股份有限公司，饲料批号1103221900005886；生酮饲料购自深圳捷利康科技有限公司，饲料批号TP201419；血糖仪和血酮仪购自北京怡成电子生物科技股份有限公司。

1.3 动物模型建立与饲养

裸鼠于SPF环境中饲养1周后接种细胞。将处于对数生长期的A549细胞用0.25%胰酶消化，收获并计数，调整浓度为1.0×107/mL，用1 mL注射器将调整好浓度的细胞悬液注射到裸鼠右下肢皮下，每只接种0.2 mL，共接种10只。接种细胞后，每日观察裸鼠饮食、精神、大小便、活动及成瘤情况。接种后第8天，肉眼可见接种处有隆起，为椭圆状。接种后第10天，10只裸鼠均成瘤，随机分为2组，每组5只，分别为标准饮食组(standard diet，SD)和KD组。分组当天称量裸鼠体质量，游标卡尺测量移植瘤长径(a)、短径(b)，按体积公式V=1/2(ab2)计算移植瘤体积，以后每5 d测量1次。SD组裸鼠自由进食标准饲料，KD组裸鼠的饲料量为SD组裸鼠前24 h进食量相等热量对应的生酮饲料。标准饲料呈颗粒状，每100 g含蛋白质23.8 g，脂肪5.6 g，碳水化合物48.2 g，总热量为348 kcal。生酮饲料呈黄色糊状，每100 g饲料含蛋白质8.3 g，脂肪66.5 g，碳水化合物8.3 g，总热量为664.9 kcal。接种后第30天，摘眼球取血处死裸鼠。处死裸鼠后，剥离移植瘤组织，取约一部分瘤体组织迅速放入-80℃冰箱中，用于Western blot检测，其余瘤体组织放入10%福尔马林固定液中，用于免疫组化染色。

1.4 血糖、血酮、血脂检测

接种后第10天，采用北京怡成血糖仪和血酮仪通过尾静脉采血，分别将血滴于血糖试纸和血酮试纸上，测量相应数值，以后每5 d测量1次。接种后第30天，摘眼球取血送本院检验科进行血脂四项检测，检测项目包括总胆固醇(total cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.5 Western blot检测移植瘤组织中4-HNE蛋白的表达

取-80℃冷冻保存的移植瘤组织，加入适量的RIPA裂解液研磨匀浆，冰上静置30 min，离心后取上清。BCA法测定蛋白浓度。配置浓缩胶和分离胶。蛋白变性后行10%SDS-PAGE，并将电泳分离的蛋白转移至PVDF膜上，用含脱脂奶粉的封闭液封闭处理1 h，加入一抗(按1∶1 000稀释)，4℃反应过夜。TBST液洗膜3次，每次10 min；加入二抗(按1∶3 000稀释)，室温反应2 h，TBST液洗膜3次，每次15 min，用电化学发光试剂显影。采用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析，目的蛋白的相对表达水平为目的蛋白条带灰度值与内参β-actin蛋白条带灰度值的比值。

1.6 免疫组织化学染色检测移植瘤组织4-HNE蛋白的表达

取10%中性福尔马林固定的移植瘤组织，常规脱水，经石蜡包埋后切片。将切片按照免疫组化试剂盒说明书进行染色，观察4-HNE蛋白的表达情况。以肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，采用半定量积分法判断结果。每张切片随机选取5个高倍视野(400×)，计算阳性细胞百分率(0～1%记0分，≥1%～10%记1分，≥10%～50%记2分，≥50%～80%记3分，≥80%～100%记4分)；染色强度(无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分)。免疫组化评分=阳性细胞百分率评分×染色强度，以免疫组化染色积分反映4-HNE的表达情况。

1.7 统计学方法

所得数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料数据用±s表示。符合正态性分布的数据采用两独立样本t检验；不符合正态性分布的数据采用秩和检验。以α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 裸鼠体质量变化

裸鼠体质量的测量结果见图1。从整个实验期间的观察来看，SD组裸鼠体质量增长明显，KD组裸鼠体质量增长趋势较缓。接种后第20天，SD组裸鼠体质量为(17.78±0.27)g，KD组为(16.70±0.54)g，两组裸鼠体质量相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 裸鼠的体质量变化情况

2.2 裸鼠血糖、血酮及血脂浓度的变化

2.2.1 血糖浓度变化血糖浓度的检测结果见图2。接种后第10天，SD组和KD组裸鼠血糖浓度分别为(8.74±1.34)和(8.50±1.85)mmol/L，差异无统计学意义(P＞0.05)。自接种后第15天起，KD组裸鼠血糖浓度较SD组有所降低，差异均有统计学意义(P均＜0.05)。接种后第30天，SD组和KD组裸鼠血糖值分别为(7.16±0.50)和(4.72±0.73)mmol/L，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图2 裸鼠的血糖浓度变化情况

2.2.2 血酮浓度变化血酮浓度的检测结果见图3。接种后第10天，SD组和KD组裸鼠血酮浓度分别为(0.18±0.08)和(0.22±0.08)mmol/L，差异无统计学意义(P＞0.05)。自接种后第15天起，KD组裸鼠血酮浓度均高于SD组，差异均有统计学意义(P均＜0.05)。接种后第30天时，SD组和KD组裸鼠血酮浓度分别为(0.22±0.08)和(1.82±0.31)mmol/L，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图3 裸鼠的血酮浓度变化情况

2.2.3 血脂浓度变化血脂浓度的检测结果见表1。KD组裸鼠的CHOL、HDL-C、LDL-C浓度高于SD组，而TG浓度低于SD组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 裸鼠的血脂浓度变化情况(mmol/L，±s，n=5)

表1 裸鼠的血脂浓度变化情况(mmol/L，±s，n=5)

与SD组比较，*P＜0.05.

SD KD 1.98±0.42 5.91±0.34*1.64±0.10 0.62±0.25*0.69±0.35 2.45±0.30*0.98±0.41 2.30±0.36*

2.3 裸鼠移植瘤体积变化情况

裸鼠移植瘤体积的测量结果见图4。KD组裸鼠移植瘤生长速度较SD组缓慢。接种后第10天、第15天时，两组裸鼠移植瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05)。接种后第20天，KD组裸鼠移植瘤体积小于SD组，SD 组为(316.17±85.47)mm3，KD组为(209.13±30.51)mm3，差异有统计学意义(P＜0.05)。接种后第30天，SD组裸鼠移植癌体积为(520.68±44.67)mm3，KD组为(388.48±42.27)mm3，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图4 裸鼠移植瘤的生长情况

2.4 Western blot检测结果

图5 Western blot法检测两组裸鼠移植瘤组织中4-HNE蛋白的表达

Western blot实验的结果见图5。4-HNE蛋白在SD组和KD组移植瘤组织中相对表达水平分别为1.00±0.03和1.45±0.10，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 免疫组织化学检测结果

免疫组化实验结果见图6，4-HNE的阳性染色为棕黄色。半定量分析结果(图7)显示，KD组裸鼠移植瘤组织中4-HNE蛋白免疫组化染色积分(4.40±0.89)高于SD组(2.40±0.89)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图6 裸鼠移植瘤组织4-HNE蛋白免疫组织化学染色后观察

图7 移植瘤组织中4-HNE蛋白免疫组织化学染色半定量分析

3 讨论

1921年Wilder等[7]发现KD能够治疗难治性癫痫，降低癫痫患者的发作频率，被认为是一种安全有效的非药物治疗方式。最近的研究表明KD能够改变肿瘤细胞新陈代谢，可能会对肿瘤生长产生影响[8-9]。现已有一些国内外动物模型研究如恶性胶质瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌等均表明，KD具有抑制肿瘤生长作用，但其抗肿瘤机制还不完善。

本研究通过建立人肺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，分别给予标准饮食和生酮饮食，观察两组裸鼠移植瘤的生长情况。结果显示，自接种后第20天起，KD组裸鼠移植瘤体积小于SD组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果表明KD可以抑制裸鼠移植瘤的生长，这与国内外相关研究结果一致。Zuccoil等[10]对1例65岁多形性胶质母细胞瘤的女性患者，在接受化疗和放疗的同时，采用生酮饮食2个月，发现患者血酮体浓度升高，肿瘤消失。Freedland和Masko等[11-12]建立小鼠前列腺癌动物模型，也发现了KD能够抑制肿瘤生长。Zhou等[13]建立鼠CT-2A及人U87脑恶性肿瘤动物模型，分别给予未限制总热量的标准饮食(SD-UR)、未限制总热量的KD(KD-UR)和限制总热量的KD(KDR)。结果显示与SD-UR和KD-UR组相比，KD-R组肿瘤生长速度显著降低，而SD-UR组和KD-UR组之间无明显差异。在本研究中，我们采用的也是限制总热量的生酮饮食方案，即KD组裸鼠的饲料为SD组裸鼠前24 h进食量相等热量对应的生酮饲料。虽然限制总热量的KD使裸鼠移植瘤的生长得到了减缓，但我们的研究还发现与SD组相比，KD裸鼠自接种后第20天起体质量出现了下降。有研究报道在限制总热量的情况下，裸鼠体质量在开始生酮饮食8 d内下降20%～30%[13]。Masko等[12]研究表明喂食NCKD及10%和20%碳水化合物的裸鼠需要额外摄入7.5%～10%的热量才能和标准饮食组的裸鼠保持相似的体质量。国内学者郝光伟提出不限制总热量的生酮饮食也具有抑制肿瘤生长的作用[14]。鉴于这种情况，我们考虑在后续的研究中采用不限制总热量喂养，观察其对裸鼠体质量以及移植瘤生长的影响。

有学者指出喂养生酮饮食48 h或者更长时间，血酮浓度＞0.3 mmol/L，可被认为达到酮症状态[15]。本研究自喂养生酮饲料第5天起，KD组即达到酮症状态，并持续至实验结束。观察发现，KD组裸鼠血酮浓度较SD组明显升高，这是因为KD为高脂肪、低碳水化合物饮食，给予KD后，大量的脂肪酸分解产生酮体，且肿瘤细胞由于线粒体功能障碍和利用酮体所必需的酶下调，导致不能有效利用酮体供能，所以出现血酮浓度升高。有研究指出生酮饮食抗肿瘤的机制与血糖及血酮浓度的变化有关，但这一看法还未得到明确肯定[16]。就目前肿瘤动物模型研究来看，KD对血糖浓度的影响是有争议的。Aggarwal等[17]给接种甲状腺癌细胞的裸鼠分别喂养SD和KD。结果发现KD组裸鼠的血酮浓度高于SD组，差异有统计学意义，但两组之间的血糖浓度无显著差异，这与Otto等[18]研究结果一致。我们推测这可能是由于所选择的动物模型和肿瘤类型不同或生酮饲料和标准饲料的脂肪酸组成不同所致。因此，生酮饮食发挥抗肿瘤作用是否伴随血糖浓度的下降还需进一步研究。

我们进一步研究这种高脂肪饮食是否会对血脂产生不利影响，在接种后第30天对两组裸鼠的血脂进行了检测。结果发现，与SD组相比，KD组裸鼠的CHOL、LDL-C、HDL-C浓度增加，TG浓度减小，差异均有统计学意义。我们都知道，CHOL和LDL-C浓度的增加对心血管系统的影响是不利的，但HDL-C和TG的变化则是有益的。总体上来说，生酮饮食并未对血脂产生较大的不利影响。

肿瘤细胞因线粒体电子传输链功能失调，导致这些电子传输链生成的活性氧增多。相对于正常细胞，肿瘤细胞被认为存在慢性代谢氧化应激状态[19]。如果活性氧的水平不断增加，那么它们很容易受到因氧化应激诱导的细胞凋亡[20-21]。为了保持氧化还原的平衡，肿瘤细胞通过激活转录因子NFE2相关因子2增加抗氧化剂的生成，用来限制活性氧的过度积累，避免受到因氧化应激所造成的损伤[22-24]。Albright等[25]研究发现，与邻近的正常细胞相比，乳腺癌细胞中抗氧化剂水平显著增加。虽然肿瘤细胞自身具有抗氧化能力，但是当通过采用外源性增强机体氧化应激水平的治疗方法时，可以促使其死亡。在本研究中我们分别使用Western blot和免疫组化法检测两组裸鼠移植癌组织中4-HNE蛋白的表达水平。结果发现，KD组裸鼠移植癌组织中4-HNE蛋白的表达高于SD组。KD通过限制葡萄糖的供应，迫使肿瘤细胞依赖线粒体氧化代谢来产生能量，继而增强肿瘤细胞氧化应激，促使其死亡。研究表明KD的抗肿瘤机制可能与肿瘤细胞氧化应激的增强有关。

Warburg效应为肿瘤治疗提供了新的方向。大量的研究数据表明生酮饮食可以延缓肿瘤生长，具有可操作性强、成本低、副作用小等优点，既可以单独使用，也可以与其他抗肿瘤治疗方法联合使用，可以作为一种易于实施的辅助治疗手段用于临床工作中。近些年KD与放化疗联合应用于肿瘤动物模型成为一个热点，且大多都取得不错的效果，但还需要足够数量的临床研究来支持。本研究将会为生酮饮食或联合其他疗法治疗肺癌提供一定的参考依据。