RNA结合基元蛋白24通过调控HOTAIR表达抑制鼻咽癌细胞增殖

陈 琪，钟 茜*，岳文涛，*

(1．首都医科大学附属北京妇产医院中心实验室，北京 100026；2．华南肿瘤学国家重点实验室/中山大学肿瘤防治中心/肿瘤医学协同创新中心，广东 广州 510060)

鼻咽癌是一种发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。中国南部是全球范围内鼻咽癌发病率最高的地区，每年全球约40%的新增鼻咽癌病例发生于中国南部地区[1]，发病率约为0.2‰～0.3‰[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染及其编码的致癌因子潜伏膜蛋白1(latent membrane protein-1，LMP1)是鼻咽癌重要的影响因子[3-7]。但是，虽然EBV携带率高达90%～95%[8]，却不是每个携带者都会发生鼻咽癌。因此，寻找更多EBV之外的鼻咽癌致癌因子对于深入了解鼻咽癌发病机制，寻找鼻咽癌诊断和治疗靶点具有重要的意义。

RNA结合蛋白是RNA转录，miRNA加工，DNA损伤反应，Th2细胞分化过程的重要影响因子[9-10]。本课题组之前的研究[11]发现，RNA结合基元蛋白24(RNA-binding motif protein 24，RBM24)在鼻咽癌组织中表达量显著低于癌旁组织。这提示我们，RBM24可能对鼻咽癌起抑制作用。但是，RBM24影响肿瘤发生发展相关的通路和机制仍不明确。

作为一种长链非编码RNA，HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)在鼻咽癌组织中表达量显著升高[12-13]，敲除HOTAIR后鼻咽癌细胞增殖显著减慢[12]。目前在鼻咽癌中RBM24与HOTAIR的关联尚未见报道。研究[14]表明，在乳腺癌、前列腺癌和前列腺良性病变细胞中，肺腺癌转移相关转录本1(metastasisassociatedlung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)能够结合到HOTAIR的启动子区，参与调控基因表达。在鼻咽癌中，RBM24可以调控MALAT1表达[11]，MALAT1可能也会结合到HOTAIR的启动子区并调控其表达。因此我们推测，鼻咽癌中RBM24可能与HOTAIR存在关联。故本文拟探讨RBM24是否通过调控HOTAIR来影响鼻咽癌细胞的增殖。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RPMI-1640培养基、Opti-MEM无血清培养基、角化细胞培养基(keratinocyte/serum-free medium，KSFM)、RNAiMAX均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。siRNA和随机对照购自广州锐博生物科技有限公司。GoScript反转录系统购自美国Promega公司。SYBR Green PCR master mix购自美国Bio-Rad公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本Dojindo公司。

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测使用Light Cycler 480 II System(Roche)仪器。

1.2 细胞培养与RBM24敲低

鼻咽癌细胞CNE1为本实验室所保存，使用含10%血清的RPMI-1640培养基培养。永生化鼻咽上皮细胞N5为本实验室所保存，NP69来源于香港中文大学解剖系，均使用K-SFM培养。所有细胞于37℃、CO2体积分数为5%条件下培养，均采用0.25%胰酶-EDTA消化传代。

每种细胞分为3组进行，即随机对照组、siRBM24-1转染组、siRBM24-2转染组。每组细胞按照每孔3×105个细胞接种于6孔板，24 h后用RNAiMAX试剂进行转染，按照说明书操作。即分别将 25 pmol siRNA、 7.5 μL RNAiMAX 用 150 μL Opti-MEM无血清培养基稀释，将稀释混合液室温孵育5 min后加入细胞中进行转染，在37℃、CO2体积分数为5%条件下培养72 h，收集细胞。siRNA和随机对照购自广州锐博生物科技有限公司。RBM24敲低时siRBM24-1使用的序列为：CCCTTATACAAAGACCT TT；siRBM24-2使用的序列为：GAGCTGCATACGCA CAATA。

1.3 RNA表达量检测

每种细胞经过对照组siRNA或RBM24 siRNA转染72 h后，收集细胞沉淀，加入1 mL Trizol重悬，室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿，旋涡振荡15 s，室温放置5 min后，4℃、12 000 g离心15 min，吸取上层无色液体至新的EP管中。加入0.5 mL异丙醇，室温静置10 min后，4℃、12 000 g离心10 min。用75%乙醇洗涤RNA沉淀，并置于空气中干燥10 min后，用DEPC ddH2O溶解细胞总RNA。

使用GoScript反转录系统试剂，按照说明书操作，将1 μg RNA反转录为cDNA。使用1 μL cDNA(20 μL反应体系)进行实时荧光PCR反应。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸60 s，变性、退火、延伸循环40次。以GAPDH作为内参。试验重复3次。采用相对定量方法(2-ΔΔCT>)对结果进行分析。qPCR使用的引物序列(5′-3′)如下：RBM24-F，CCAAGGATCATGCAACCAG；RBM24-R， GCAGGTATCCCGAAAGGTCT。 HOTAIR-F， CAG TGGGGAACTCTGACTCG； HOTAIR-R， GTGCCTGGT GCTCTCTTACC。 GAPDH-F， AACTCTGGTAAAGTGG ATATTG；GAPDH-R，GGTGGAATCATATTGGAACA。

1.4 细胞增殖率检测

在96孔板中每孔加入1 000个细胞，每种细胞分为随机对照组和RBM24敲低组，每个处理组重复3次。敲低后24 h，在RBM24敲低组和对照组中分别加入10 μL CCK-8，处理2 h后检测细胞D(450)值。此外，在敲低后第2～5天，每天检测D(450)值，并分析细胞增殖情况。

1.5 统计学处理

所得数据采用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料以±s表示，两组间差异用Student'st检验进行分析。

2 结果

2.1 RBM24敲低对RBM24 mRNA表达量的影响

qPCR结果显示，敲低前永生化鼻咽上皮细胞NP69、N5中RBM24 mRNA的表达量分别为4.73±0.56和7.01±0.78，显著高于鼻咽癌细胞CNE1(1.00±0.06)，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01，图1A)。用RBM24 siRNA-1和siRNA-2转染细胞后，CNE1细胞中RBM24 mRNA表达量分别为0.28±0.21和0.07±0.09，相比对照组(1.00±0.06)显著降低，差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01，图1B)。同样的，N5细胞的RBM24siRNA-1和siRNA-2转染组中RBM24 mRNA表达量分别为0.13±0.07和0.09±0.01，相比对照组(1.00±0.11)显著降低，差异具有统计学意义(P均＜0.01，图1C)。而在NP69细胞的siRNA-1和siRNA-2处理组中，RBM24 mRNA表达量分别为0.08±0.02和0.22±0.03，相比对照组(1.00±0.12)显著降低，差异亦具有统计学意义(P均＜0.01，图1D)。上述结果提示RBM24敲低细胞模型构建成功。由于siRNA-1与siRNA-2效果基本相同，后续实验仅选用siRNA-1进行。

图1 RBM24敲低对细胞中RBM24 mRNA表达量的影响

2.2 RBM24敲低对细胞增殖率的影响

采用CCK-8检测RBM24敲低对细胞增殖率的影响，结果见表1。第3天和第4天时鼻咽癌CNE1细胞的RBM24敲低组增殖率(5.11±0.03)高于对照组(4.53±0.05)，差异具有统计学意义(P＜0.01)，表明，RBM24敲低可以显著促进鼻咽癌细胞增殖。在永生化鼻咽上皮N5细胞中，第4天时RBM24敲低组细胞增殖率(2.09±0.18)亦高于对照组(1.73±0.12)，差异具有统计学意义(P＜0.05)，这表明，RBM24敲低可以促进N5细胞的增殖。但是，在另一株永生化鼻咽上皮细胞NP69中，RBM24敲低对细胞增殖的影响与N5并不相同，第4天时NP69细胞的RBM24敲低组细胞增殖率与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 RBM24敲低对细胞增殖率的影响

2.3 RBM24敲低后细胞中HOTAIR mRNA的表达

为确定RBM24与HOTAIR的关联，采用qPCR分析RBM24敲低后HOTAIR mRNA的表达，结果见图2。在CNE1细胞的RBM24敲低组中，HOTAIR mRNA表达量(67.54±1.87)相比对照组(1.00±0.21)显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，与CNE1细胞RBM24敲低组细胞增殖率显著升高相吻合。N5细胞的RBM24敲低组中，HOTAIR mRNA表达量为7.81±1.90，相比对照组(1.00±0.19)明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与N5的RBM24敲低组细胞增殖显著加快相吻合。同样的，在NP69的RBM24敲低组细胞中，HOTAIR mRNA表达量(1.31±0.15)与对照组(1.00±0.04)比较变化不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，与NP69细胞中RBM24敲低组增殖变化不明显相吻合。

上述实验表明，RBM24敲低后，永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞的增殖变化情况，与HOTAIR mRNA表达增加情况相符。提示，RBM24敲低可能通过上调HOTAIR表达来促进细胞增殖。

图2 RBM24敲低后对HOTAIR mRNA表达量的影响

3 讨论

鼻咽癌早期症状不明显，发病位置较为隐蔽，大多数鼻咽癌患者确诊时已经属于晚期[15]。而晚期鼻咽癌患者生存率低下，III～IV期鼻咽癌患者的平均生存时间只有3年[15-16]，因此阐明鼻咽癌发生发展的机制、寻找早期诊断的方法，对于鼻咽癌的预防与治疗极为重要。目前关于RBM24在鼻咽癌中作用机制的研究非常少，本文主要围绕RBM24敲低是否通过调控HOTAIR mRNA表达来影响鼻咽癌细胞的增殖进行研究。

过去，RBM24主要被认为通过调控转录翻译，调节mRNA稳定性和参与选择性剪接等方式在胚胎干细胞分化[17]、心脏和肌肉发育[18-20]等过程中发挥作用。近年的研究表明，RBM24也是一种抑癌基因。Jiang等[21]发现RBM24可以通过结合p21转录本来促进p21表达，从而使p53缺失的肿瘤恢复正确的细胞周期。RBM24也可以结合到p63的3′端非编码区，从而调控p63转录本的稳定性[22]。本课题组前期研究[11]表明，RBM24在鼻咽癌组织中表达量显著低于癌旁组织，在肿瘤中过表达RBM24可以抑制细胞增殖。本研究发现，在鼻咽癌细胞中进一步将RBM24敲低，可以使细胞增殖显著增加，这说明RBM24进一步缺失会造成鼻咽癌细胞恶性程度增高。

除了鼻咽癌发展过程，RBM24在鼻咽癌的发生过程中也发挥一定的作用。正常细胞向癌细胞转化过程的相关研究比较少，机制尚不明确。永生化鼻咽上皮细胞是在正常鼻咽上皮细胞中转入Bmi-1、SV40 large T antigen(SV40T)、HPV16E6/E7、端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)等因子诱导永生化得到的细胞系，这类细胞仍然具有正常鼻咽上皮的特性[23-25]，适用于研究肿瘤发生的过程。体外培养的永生化鼻咽上皮细胞N5和NP69中RBM24表达量高于肿瘤细胞CNE1。与对照组相比，RBM24敲低后第4天N5细胞增殖加快，提示RBM24缺失可能在永生化鼻咽上皮细胞向肿瘤细胞转化过程中发挥作用。

本研究进一步分析RBM24影响鼻咽癌细胞增殖的机制。HOTAIR是一种促癌因子，其不仅可以促进乳腺癌、卵巢癌的侵袭和转移[26-28]，也可以通过上调脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)来促进鼻咽癌发展与复发[12]。HOTAIR可以通过选择性剪接产生多种转录本[29]。例如，HOTAIR的5′端具有多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)结合域，可以通过选择性剪接去除该PRC2结合域[30-31]。HOTAIR能够通过PRC2结合域招募并结合PRC2，从而抑制微小核糖核酸34(microRNA 34a，miR34a)表达，促进肿瘤转移[32]。HOTAIR还能够通过3′端的赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)结合域发挥促癌作用[29]。由于RBM24具有RNA结合与选择性剪接调控功能，我们推测，RBM24可能参与HOTAIR RNA选择性剪接过程，调控不同转录本的产生，从而影响肿瘤发生发展。本研究表明，RBM24敲低可以促进永生化鼻咽上皮细胞N5和鼻咽癌细胞CNE1的细胞增殖，与之相符的，这些细胞中HOTAIR mRNA表达量升高。这提示，RBM24敲低后促进细胞增殖的作用可能与HOTAIR的表达上调相关，RBM24敲低后如果HOTAIR表达量上调，则可以促进细胞增殖(图3)。但是永生化鼻咽上皮细胞NP69中HOTAIR表达量不变，细胞增殖也未发生显著改变，提示可能有其他因素维持HOTAIR表达量稳定，从而阻碍RBM24敲低对细胞增殖的促进作用(图3)。此外，本研究使用的HOTAIR qPCR引物检测的是HOTAIR转录本1和2的总表达量，并不能区分不同HOTAIR转录本的表达量。RBM24敲低对不同HOTAIR转录本表达量的影响，及其在鼻咽癌发生发展中的作用尚待解析。

图3 RBM24通过调控HOTAIR表达来影响细胞增殖

肿瘤细胞与正常细胞相比，缺失了一些维持细胞正常特征的机制，而这类维持细胞正常特征的机制对于肿瘤的预防和治疗有重要意义。虽然肿瘤细胞中RBM24缺失会进一步加快细胞增殖，但是在永生化鼻咽上皮细胞N5和NP69中敲低RBM24后，前者HOTAIR表达量显著上升，细胞增殖加快，而后者HOTAIR表达量与细胞增殖变化都不明显。提示可能有其他机制在RBM24缺失后能够继续维持NP69细胞的HOTAIR表达量和细胞增殖的稳定。比较N5和NP69细胞的差异可知，N5细胞是在正常鼻咽上皮细胞中转入TERT诱导得到的永生化鼻咽上皮细胞系(类似于NP460hTert细胞[25])，而NP69细胞是转入SV40T诱导得到的永生化细胞系[23]。由于诱导方式的差异，两种永生化鼻咽上皮细胞系的基因表达差异和信号通路差异可能是造成RBM24敲低后HOTAIR和细胞增殖变化不同的原因。但是，目前尚缺少SV40T与TERT两种诱导方式影响HOTAIR的报道，也缺少RBM24调控HOTAIR的机制研究。可能在正常鼻咽上皮细胞中过表达SV40T与TERT后，两种因子分别激活不同的信号通路来实现细胞永生化，因此细胞的基因表达也不一样。相较于N5细胞，NP69细胞中可能存在某种因子(蛋白或非编码RNA等)的高表达，而这种因子可以阻断RBM24-HOTAIR信号通路；NP69也可能缺失某种因子，而这种因子是RBM24-HOTAIR通路所必需的。进一步比较N5和NP69细胞之间的蛋白和非编码RNA的表达差异，分析RBM24调控HOTAIR的通路，有助于解析正常细胞中维持HOTAIR和细胞增殖稳定性的机制，这对于阐明正常细胞癌变过程的机制有重要作用。

综上所述，本研究发现，鼻咽癌细胞CNE1和永生化鼻咽上皮细胞N5中，RBM24表达量降低可以显著促进HOTAIR的升高，从而促进鼻咽癌细胞增殖。提示RBM24和HOTAIR有望成为鼻咽癌预防和治疗的靶位点。然而，RBM24表达量降低后，永生化鼻咽上皮细胞NP69中HOTAIR mRNA表达和细胞增殖的变化不明显，可能有其他机制参与维持HOTAIR表达量和细胞增殖稳定性，相关机制有待进一步研究。