miR-30a-5p和NUAK1在非小细胞肺癌中的表达及对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

李爱明，刘 克，王园园，王 乾

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的85%[1, 2]。尽管近年来在癌症研究和治疗方面取得了较大进展，但NSCLC的预后仍然很差，其5年生存率仅为15%[3]。因此，了解NSCLC的发病机制并确定新的治疗靶点非常重要[4]。最近研究发现，miRNA与肺癌的发展密切相关，且有用miRNA阵列实验发现miR-30a-5p在NSCLC组织中的表达显著下调[5-7]。然而，miR-30a-5p在非小细胞肺癌中的作用和分子机制仍未完全阐明。新式激酶家族1[Novel (nua) kinase family 1，NUAK1]，也称为KIAA0537/ARK5，已被确定为单磷酸腺苷激活蛋白激酶相关激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase related kinase，ARK)家族的第5个成员[8]。NUAK1可以被Akt直接激活，活化的NUAK1可以在葡萄糖饥饿和死亡受体刺激过程中促进细胞存活[8]。最近有研究表明，NUAK1的高表达与结肠癌的肿瘤进展有关，并且可以通过与p53的直接相互作用来调节细胞增殖[9]。此外，NUAK1高表达与预后不良相关，并参与NSCLC细胞的迁移和侵袭[8]。然而，NUAK1在NSCLC中的调控机制仍不清楚。本研究将通过研究miR-30a-5p、NUAK1在NSCLC中的表达及miR-30a-5p靶向NUAK1对NSCLC细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响，以揭示NSCLC发生发展的分子机制，为临床诊断治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016-09至2019-03我院行手术切除治疗的NSCLC患者癌组织和癌旁组织标本各64例，其中男37例，女27例，年龄37～76岁，平均(47.3±10.8)岁；高分化26例，中低分化38例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期24例，Ⅲ/Ⅳ例40例。所有样本组织均经至少2名病理医师诊断为NSCLC，且患者术前未接受任何治疗。本研究方案经医院伦理学委员会审核批准，受试患者或其家属均签署知情同意书。

1.2 细胞 人正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞系H460、H1299和A549购自美国模式培养物保藏所(american type culture collection，ATCC)，保存于我院中心实验室的液氮罐中。

1.3 主要试剂与仪器 DMEM培养液、F-12K培养液、RPMI-1640培养液、胎牛血清、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、青-链霉素、胰蛋白酶溶液购自美国Hyclone公司；Lipofectmine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTM购自大连TaKaRa公司；放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶偶联二抗、购自上海碧云天生物技术有限公司；pmiRGLO载体、Dual Luciferase®Reporter Assay System试剂盒购自美国Promega公司；miR-NC、miR-30a-5p、pcDNA3.1 载体和pcDNA3.1-NUAK1载体购自广州锐博生物技术有限公司；噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国Corning公司；NUAK1、GAPDH抗体购自美国abcam公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜、增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购自德国Merck Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 BEAS-2B和H1299用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，A549用含10%胎牛血清的F-12k培养液培养，H460用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，并置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。

1.4.2 细胞转染 取2×105个对数生长期A549细胞接种于6孔板中，随机分为4组，每组3个复孔，待细胞融合度达60%时，用Lipofectmine 2000转染试剂分别将miR-NC、miR-30a-5p、miR-30a-5p联合pcDNA 3.1载体或pcDNA 3.1-NUAK1载体转入A549细胞中，分别记为miR-NC组、miR-30a-5p组、miR-30a-5p+Vector组和miR-30a-5p+NUAK1组，培养48 h后，提取RNA和蛋白进行后续实验研究。

1.4.3 qPCR检测 利用RNAiso plus试剂盒提取非小细胞肺癌样本和细胞中总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行逆转录，SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒上机检测各个样本中miR-30a-5p和NUAK1的表达，分别以U6和GAPDH为内参。miR-30a-5p正向引物：5′-CAC TCT CAT GTA AAC ATC CTC GAC-3′，反向引物:5′-TAT GGT TGT TCT GCT CTC TGT GTC-3′；U6正向引物：5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物：5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。NUAK1正向引物：5′-ATG CTA AGT ACC CTC TGA ATG-3′ ，反向引物：5′-GCA ACA AGC AGT CAG TCG ATC-3′；GAPDH正向引物：5′-AAG GTG AAG GTC GGA GTC A-3′，反向引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT T-3′。

1.4.4 Western blot检测 用RIPA裂解液提取非小细胞肺癌样本和细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel-electrophoresis，SDS-PAGE)电泳分离蛋白样品，后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别用NUAK1和GAPDH抗体于4 ℃孵育过夜，后用Tris缓冲液吐温20(Tris-Buffered Saline Tween-20，TBST)洗涤3次，每次10 min，辣根过氧化物酶偶联二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后用ECL发光液孵育条带并置于化学发光成像系统中进行曝光显影，Image J软件相应蛋白的相对表达水平。

1.4.5 双荧光素酶报告实验 用RNAiso plus提取A549细胞总RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录得cDNA，后扩增NUAK1的3′UTR并将其克隆至pmirGLO载体中构建pmirGLO-NUAK1-Wt重组载体。根据TakaRa点突变试剂盒将pmirGLO-NUAK1-Wt中miR-30a-5p的结合位点进行突变，构建pmiRGLO-NUAK1-Mut重组质粒。用Lipofectmine 2000将pmirGLO-NUAK1-Wt/Mut报告载体分别与miR-NC或miR-30a-5p共转至A549细胞中，48 h后用Dual Luciferase®Reporter Assay System试剂盒检测各组细胞荧光素酶活性。

1.4.6 细胞增殖检测 取对数生长期的miR-NC组、miR-30a-5p组、miR-30a-5p+Vector组和miR-30a-5p+NUAK1组细胞分别接种于96孔板中，每孔接种4000个细胞，每组设3个复孔，分别于24 h、48 h和72 h时，每孔加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，培养箱中孵育4 h，后弃去上清液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜，用酶标仪震荡10 min以溶解结晶并检测490 nm处各孔吸光值。

1.4.7 细胞迁移侵袭检测 取预铺基质胶和无预铺基质胶的Transwell小室置于24孔板中，其中预铺基质胶的小室每孔加入50 μl无血清培养液润化30 min，无预铺基质胶的小室不做任何处理。取1×105个对数生长期的miR-NC组、miR-30a-5p组、miR-30a-5p+Vector组和miR-30a-5p+NUAK1组细胞接种至Transwell小室中，添加无血清培养液至200 μl，下室中加600 μl完全培养液，每组设置3个复孔。培养48 h后，PBS洗涤2次，100%甲醇固定10 min，晾干，0.1%结晶紫染色10 min，去离子水洗去残留染液，显微镜下观察并拍照，计数各组迁移侵袭细胞数。

2 结 果

2.1 miR-30a-5p和NUAK1在NSCLC组织中的表达 与癌旁组织相比，NSCLC组织中miR-30a-5p的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；NUAK1 mRNA和蛋白表达高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05，图1，表1)。

图1 非小细胞肺癌组织中NUAK1蛋白表达

表1 非小细胞肺癌组织和癌旁组织中miR-30a-5p和NUAK1的表达量

2.2 miR-30a-5p和NUAK1在NSCLC细胞中的表达 与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比，非小细胞肺癌细胞系H460、H1299和A549中miR-30a-5p相对表达量降低(P<0.05)，NUAK1 mRNA和蛋白相对表达量增加(P<0.05，图2、表2)。

图2 非小细胞肺癌细胞中NUAK1蛋白表达A.BEAS-2B；B.H460；C.H1299；D.A549

表2 人正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞系H460、H1299和A549中miR-30a-5p和NUAK1的表达

2.3 miR-30a-5p与NUAK1靶向结合 利用TargetScan网站预测发现NUAK1可能是miR-30a-5p的潜在靶基因(图3)。与miR-NC组(1.00±0.09)相比，miR-30a-5p组后A549细胞中miR-30a-5p表达量(4.23±0.42)显著升高，差异有统计学意义(t=13.025，P<0.05)。miR-30a-5p组A549细胞中NUAK1-Wt荧光素酶活性(0.45±0.05)较miR-NC组(1.00±0.09)显著降低(t=9.253，P<0.05)，而miR-30a-5p组NUAK1-Mut荧光素酶活性(0.96±0.09)与miR-NC组(1.01±0.10)比较差异无统计学意义(t=0.644，P>0.05)。

图3 预测的miR-30a-5p与NUAK1 3′UTR结合位点

2.4 miR-30a-5p可抑制A549细胞中NUAK1蛋白表达 与miR-NC组(0.62±0.06)相比，miR-30a-5p组中NUAK1蛋白相对表达量(0.26±0.03)显著降低，差异有统计学意义(t=9.295，P<0.05)。miR-30a-5p+NUAK1组A549细胞中NUAK1蛋白相对表达量(1.08±0.11)明显高于miR-30a-5p+Vector组(0.24±0.02)，差异有统计学意义(t=13.013，P<0.05，图4)。

图4 过表达miR-30a-5p及联合过表达NUAK1后A549细胞中NUAK1蛋白表达

2.5 miR-30a-5p对A549细胞增殖的影响 48 h和72 h时miR-30a-5p组吸光度值低于miR-NC组，差异有统计学意义(t=4.157、6.875，P<0.05)，miR-30a-5p+NUAK1组吸光度值高于miR-30a-5p+Vector组，差异有统计学意义(t=3.118、6.245，P<0.05，表3)。

表3 过表达miR-30a-5p及联合过表达NUAK1后A549细胞的相对吸光度值

A.miR-NC组；B.miR-30a-5p组；C.miR-30a-5p+Vector组；D.miR-30a-5p+NUAK1组

2.6 miR-30a-5p对A549细胞迁移侵袭的影响 miR-NC组、miR-30a-5p组、miR-30a-5p+Vector组及miR-30a-5p+NUAK1组迁移细胞数分别为124±21、65±12、54±13和131±24(图5A)，侵袭细胞数分别为103±17、43±11、46±10和96±15(图5B)。miR-30a-5p组迁移侵袭细胞数低于miR-NC组，差异有统计学意义(t=4.255、5.132，P<0.05)，miR-30a-5p+NUAK1组迁移侵袭细胞数高于miR-30a-5p+Vector组，差异有统计学意义(t=4.886、4.804，P<0.05)。

图5 过表达miR-30a-5p及联合过表达NUAK1对A549细胞迁移侵袭能力的影响

3 讨 论

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是小的非编码RNA，由19～25个核苷酸组成。 MiRNA可以通过与3′非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)结合而负调控靶基因的表达[10]。大量研究表明，miRNA在肿瘤发生的所有步骤中都可以充当肿瘤抑制因子或致癌基因[11]。MiR-30a-5p位于6q.13号染色体上，由内含子转录产生两种成熟形式的miR-30a，分别为miR-30a-3p和miR-30a-5p[12]。MiR-30a-5p在多种恶性肿瘤中失调，例如乳腺癌[13]、肝细胞癌[14]、结肠癌[15]、鼻咽癌[16]、前列腺癌[17]、子宫内膜癌[18]及皮肤癌鳞状细胞癌[19]。在肺癌中，Tang等[12]研究发现，miR-30a的低表达与肺癌预后不良有关。Zhu等[3, 5]通过NSCLC组织中microRNAs的表达谱分析发现miR-30a-5p表达下调，过表达miR-30a-5p可通过靶向CD73/NT5E抑制NSCLC细胞增殖。上述研究表明，在非小细胞肺癌中miR-30a-5p是一个抑癌miRNA。本研究发现，miR-30a-5p在NSCLC样本和细胞中低表达，过表达miR-30a-5p可抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，与Zhu等[3, 5]研究结果一致。

NUAK1也称为ARK5，是单磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)家族的成员[20]。最近的研究证据表明，NUAK1与肿瘤的进展密切相关。据报道，NUAK1是介导人胰腺癌细胞中癌细胞迁移活性的关键分子。 Gen-Ichi等[21]报道NUAK1的高表达在临床上参与了结肠癌的肿瘤进展。此外，NUAK1在乳腺癌、胃癌和卵巢癌等恶性肿瘤中高表达，且NUAK1高表达与肿瘤患者预后较差有关[22-24]。最近，Xu等[25]证明NUAK1通过诱导上皮-间充质转化赋予肝细胞癌多柔比星耐药性，Lu等[26]证明NUAK1的上调促进了神经胶质瘤的侵袭。尽管这些研究发现NUAK1在癌症进展中的重要性，但其在NSCLC中的作用仍有待研究。本研究发现，在NSCLC组织和细胞中NUAK1高表达，NUAK1是miR-30a-5p的靶基因，过表达NUAK1可逆转miR-30a-5p对非小细胞肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

综上所述，本研究证实在NSCLC组织和细胞中miR-30a-5p低表达，NUAK1高表达，miR-30a-5p可通过靶向NUAK1来抑制NSCLC细胞A549增殖、迁移和侵袭，进一步揭示了NSCLC发生发展的分子机制，可能为NSCLC的诊断和治疗提供新的靶点。