急性心肌梗死病人miR-126、miR-210表达水平及其与预后的相关性分析

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上一般表现为剧烈持久的胸骨后疼痛，伴有血清心肌酶活性增高及心电图的进行性改变，常并发心律失常、休克或心力衰竭等威胁生命的症状，一般经休息和给予硝酸酯类药物并不能缓解。近年来，我国该病的发生率、死亡率明显上升，严重威胁人民的生命健康[1-3]。降低疾病的发生率及死亡率是我国目前面临的一个重大问题。现阶段临床诊断AMI的主要方法是对病人进行心电图检查，观察心肌损伤标记物及影像学变化[4]。但是由于上述标志物对于疾病的检测并不完善，如对心肌缺血疾病的敏感性以及特异性有一定缺陷，需要反复检查，严重影响了疾病的诊断。有学者提出，microRNA表达与AMI预后可能存在重要关系，目前尚少有研究报道miR-126、miR-210的表达水平与AMI预后的相关性[5-6]。本研究拟检测AMI病人血清中miR-126、miR-210的表达水平，探讨其表达水平以及对病人预后评价的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年5月—2017年10月青岛市中心医院收治的64例AMI病人(均为采血前未接受药物治疗)作为观察组，符合AMI诊断标准[7]。其中主要的肌钙蛋白升高(至少超过99%参考值上限)，并至少伴有以下一项指标：①心肌缺血症状；②病理学Q波形成；③缺血性心电图改变，如ST-T改变或左束支传导阻滞；④影像学显示异常，如心肌活性丧失或局部壁室运动异常；⑤证实冠状动脉内有血栓。对照组：选择同期健康体检者64名(采血前未接受药物治疗)，入选标准为无胸痛、无心电图、心肌标志物、血常规、胸片、肝肾功能等异常变化。观察组和对照组排除标准：①严重肝肾功能不全病人；②自身免疫性疾病；③恶性肿瘤；④感染性疾病。两组研究对象性别、年龄、吸烟情况、高血压、收缩压、舒张压、糖尿病、肌酐、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)比较差异无统计学意义(P>0.05)。同时将AMI病人按全球急性冠脉事件登记(GRACE)评分[8]分为高危组(>140分)、中危组(109～140分)、低危组(≤108分)。详见表1。本研究内容获得病人及其家属的知情同意，并签署知情同意书，本研究经过青岛市中心医院伦理委员会批准。

表1 两组基线资料比较

注：1 mmHg =0.133 kPa。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 美国Sigma的高速冷冻离心机，Roche公司的Cobas600 E601全自动电化学发光分析仪及试管等。

1.2.2 样本收集 使用无抗凝剂的采血管抽取受试对象外周静脉血4 mL，在室温下以3 000 r/min离心15 min，使用1.5 mL PE管取上清液，存放至-80 ℃冰箱内备用。采用Roche公司的Cobas600 E601全自动电化学发光分析仪检测超敏肌钙蛋白T(cTnT)。

1.2.3 目的miRNA引物的合成 本次实验的miRNA引物均由宝生物工程公司提供并通过验证。主要设计是采用stem-loop(茎环)结构，其特异性好、长度适中，使miRNA在逆转录反应过程中的茎环不被破坏，主要是参照miRNA反转录及荧光定量引物的设计原则。同样为了使定量聚合酶的灵敏度增高，特异性结合力加强，在3′端上游引物加Poly(A)尾结构。试验中所选目的miRNA及内参的引物系列见表2。

表2 引物序列

1.2.4 总RNA提取 从-80 ℃冰箱将样品取出溶解后，按每200 μL血清样本加入Buffer RLM使其裂解，室温放置5 min，使蛋白核酸复合物分离；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液至1.5 mL PE管中；再加入200 μL 氯仿，剧烈晃动15 s后取上层无色水至离心管，取转移液体积加1.25倍的无水乙醇混匀；使用Wash buffer1洗2次，Wash buffer 2洗1次，离心30 s，倒掉废液，重回收集管，加入40 μL RNase-Free Water，室温放置1 min，12 000 r/min离心1 min，收集DNA液。

1.2.5 荧光定量聚合酶检测血清miR-126、miR-210 使用室温融化体积为25 μL的2×miRNAqPCRpremi试剂和已经均匀混合，并经短暂离心后体积为1 μL的Reverseprimer试剂置于冰上，构造反应体系；然后启动PCR仪器，其主要3步分别为：90 ℃、10 min 、1个循环，90 ℃、15 s、40个循环，60 ℃、1 min、40个循环，对目的cDNA产物进行荧光定量聚合酶反应。

1.2.6 血浆cTnT检测 使用贝克曼ACCESS2全自动化学发光仪测定观察组及对照组血浆中cTnT含量，具体方法参见使用说明书。

1.2.7 随访 对所有病人进行为期1年的随访，观察两组病人心血管不良反应发生情况，主要包括死亡、再发心肌梗死、再次血运重建和再入院等。

2 结 果

2.1 各组血清miR-126、miR-210的表达水平 观察组血清中miR-126表达水平低于对照组，而血清中miR-210表达水平高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组血清miR-126、miR-210表达水平比较(±s)

2.2 观察组血清miR-126、miR-210水平与GRACE评分分层关系 高危组血清miR-126水平低于中危组、低危组(高危组<中危组<低危组，P<0.001)；高危组血清miR-210水平高于中危组、低危组(高危组>中危组>低危组，P<0.001)。详见表4。

表4 观察组血清miR-126、miR-210水平与GRACE评分分层关系(±s)

与高危组比较，①P<0.05；与中危组比较，②P<0.05。

2.3 观察组血清miR-126、miR-210表达水平与cTnT的相关分析 血清miR-126水平表达量与cTnT呈正相关(r=0.87，P<0.001)；miR-210水平表达量与cTnT呈负相关(r=-0.42，P<0.001)。

2.4 不同血清miR-126、miR-210表达的AMI病人预后比较 随访1年后以中位数为界值，分析发现血清miR-126高表达组AMI病人心血管不良事件发生率低于低表达组(χ2=5.333，P=0.021)；血清miR-210的高表达组AMI病人心血管不良事件发生率高于低表达组(χ2=3.140，P=0.037)。详见表5。

表5 不同血清miR-126、miR-210表达组病人不良心血管事件发生率比较 单位：例(%)

与高表达组比较，①P<0.05。

3 讨 论

AMI是冠状动脉死亡的主要原因，一般发生在冠状动脉粥样硬化基础上，可因病人过度劳累、激动、暴饮暴食、吸烟、饮酒等因素导致冠状动脉粥样斑块破裂，致血小板在破裂表面形成血栓，使得动脉管腔堵塞，导致心肌缺血坏死[9-10]。目前临床对于AMI病人的诊断并不完善。

有研究发现，miRNA可作为多种疾病的生物标志物，对于血管的再生、刺激血液干细胞的形成起着一定的作用，同时还对心血管疾病的发病机制起着调节作用，而AMI作为心血管疾病的一种，主要特征是以心肌细胞坏死为主，并常伴有心肌细胞内容物释放入血，因此，受到了研究者的强烈关注。miRNA是一种类似siRNA的分子，一般成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列的加工而产生的，通常是广泛性存在于真核生物中，其长度为18～25 nt，可调节细胞生长、组织分化以及对生命的发育、疾病有重要作用，且多数的miRNA具有组织特异性、时序性、广泛性及多样性，对于细胞的生长发育起着重要作用[11-12]。

本研究观察AMI病人血清miR-126、miR-210表达水平对预后的临床价值，结果显示，观察组血清miR-126水平低于对照组，其中高危组血清miR-126水平低于中危组、低危组，由于血清miR-126表达主要存在血管内皮细胞中，能够在多方面调节维持内皮细胞，如细胞增殖、完整性、迁移等[13-14]。因此，在AMI的作用下使内皮细胞分泌miR-126受到抑制，导致血清miR-126的表达具有差异性。观察组血清miR-210表达水平高于对照组，其中高危组血清miR-210表达水平也明显高于中危组、低危组，本研究结果与有关文献研究报道一致[15-16]。cTnT作为AMI诊断金标准[17]。本次研究中AMI病人血清miR-126、miR-210表达水平与cTnT相关分析结果显示，血清miR-126水平表达量与cTnT呈正相关，miR-210水平表达量与cTnT呈负相关，可以反映出心肌细胞的损伤程度[18]。在本研究中，为了解AMI病人预后情况，对所有病人进行为期1年的随访，比较两组病人心血管不良反应发生情况，结果显示高表达组血清miR-126心血管不良事件发生率低于低表达组，血清miR-210高表达组心血管不良事件发生率高于低表达组。表明血清miR-126、miR-210水平能够反映AMI病人的预后状况，这对于后续的治疗具有一定意义。

综上所述，血清miR-126、miR-210表达水平降低或升高能够评估AMI病人的预后状况，提高临床对疾病的诊断和治疗，血清miR-126、miR-210可作为AMI危险分层指标，但是由于本次试验样本量不足，尚需要更大规模研究进一步开展。