依折麦布联合罗格列酮对平滑肌源性泡沫细胞小凹蛋白-1 mRNA表达的影响

胆固醇在血管平滑肌细胞的大量蓄积及其引发的炎症、凋亡、细胞因子的释放等是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)产生的重要机制，因此，抑制或减少胆固醇的蓄积可以减少AS的发生。研究表明，小凹是胆固醇流出的主要通道，平滑肌细胞中胆固醇的流出可减缓平滑肌细胞向泡沫细胞的转化，从而减慢粥样斑块的形成。小凹蛋白为小凹的主要骨架结构，是小凹发挥作用的靶点，在胆固醇代谢方面发挥主要作用[1-2]。动物实验和临床试验均已发现罗格列酮具有明显的抗炎、抗AS作用[3-4]。依折麦布是一种新型降脂药物，其机制是选择性抑制肠胆固醇吸收，从而起到抗AS的作用[5]。但罗格列酮及依折麦布是否通过上调小凹蛋白-1(Caveolin-1)在平滑肌源性泡沫细胞表达促进胆固醇的外流，逆转动脉粥样硬化的机制尚不明确。本研究探讨罗格列酮、依折麦布及两者联合对氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的平滑肌源性泡沫细胞Caveolin-1 mRNA表达的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMCs，齐氏细胞有限公司)，胎牛血清(上海Beyotime生物技术有限公司)，MEM/F12培养液、油红O染液(武汉博士德生物公司)，ox-LDL(北京协生生物科技有限公司)，RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒(Takala公司)，PCR引物及荧光定量PCR试剂盒(上海博士德生物公司)，胰蛋白酶(武汉Boster公司)，依折麦布(默沙东制药公司馈赠)，瑞舒伐他汀(京新药业公司)，37 ℃细胞培养箱型号3141(美国 Thermo Fisher公司)，倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，Real-timePCR仪型号Quant Studio7(美国 Applied Biosytems公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 原代大鼠胸主动脉VSMCs中加入含15%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM/F12培养基， 3～5 d传1代，取VSMCs进行实验研究。

1.2.2 泡沫细胞模型的建立与鉴定 在平滑肌细胞中加入50 μg/mL的ox-LDL干预48 h后，采用油红O染色法鉴定。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗细胞3次去除死细胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用油红O染液染色后，于显微镜下观察细胞泡沫化的情况。

1.2.3 实验分组 实验分为空白对照组不进行干预，仅单独培养平滑肌细胞48 h；泡沫细胞组用ox-LDL 50 μg/mL诱导平滑肌细胞，单独培养48 h；依折麦布组先用ox-LDL 50 μg/mL干预平滑肌细胞48 h，建立泡沫细胞模型，后加入依折麦布3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L继续培养24 h；罗格列酮组先用ox-LDL 50 μg/mL干预平滑肌细胞48 h，建立泡沫细胞模型，后加入25 μmol/L罗格列酮继续培养24 h；联合组先用ox-LDL 50 μg/mL干预平滑肌细胞48 h，建立泡沫细胞模型，后加入依折麦布30 μmol/L和罗格列酮25 μmol/L继续培养24 h。每组分析3份样本量。

1.2.4 用RT-PCR检测各组中的Cavedin-1 mRNA表达水平

1.2.4.1 RNA的提取 细胞用PBS冲洗两遍，加入1 mL Trizol，经沉淀、洗涤后，溶解于DEPC水20 μL中，利用分光光度仪Nano Drop测定样品RNA浓度及OD值。

1.2.4.2 逆转录为cDNA 采用SYBR预混的实时荧光定量PCR试剂盒，在Ep管中加入逆转录反应体系2 μL 、Total RNA 1 μg及RNase Free dH2O使总体系为10 μL，将PCR仪反应所得的cDNA置于-20 ℃下保存。

1.2.4.3 PCR扩增反应 Caveolin-1上游引物：5′-GAGCGAGAAGCAAGTGTACGA-3′，下游引物：5′-ACAGACGGTGTGGAACGTAGAT-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃预变性5 s，60 ℃退火20 s，共40个循环，各组PCR设3个副孔，以GAPDH为内参，mRNA表达相对量用2-△△CT表示。

2 结 果

2.1 VSMCs形态学观察 细胞生长旺盛，有突起、细长，局部区域重叠多层，呈“峰-谷”样。

2.2 依折麦布单药对Caveolin-1 mRNA表达的影响 与空白对照组比较，泡沫细胞组及依折麦布组Caveolin-1 mRNA表达量均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与泡沫细胞组比较，不同浓度依折麦布组Caveolin-1 mRNA表达量显著增加，且呈一定浓度依赖性(P<0.05)。详见表1。

表1 不同浓度依折麦布对Caveolin-1 mRNA表达的影响(±s)

与空白对照组比较，①P<0.05；与泡沫细胞组比较， ②P<0.05；与依折麦布3 μmol/L组比较， ③P<0.05；与依折麦布10 μmol/L组比较， ④P<0.05。

2.3 依折麦布联合罗格列酮对Caveolin-1 mRNA表达的影响 与空白对照组比较，泡沫细胞组Caveolin-1 mRNA表达量下降(P<0.05)；与泡沫细胞组比较，依折麦布30 μmol/L组、罗格列酮组及联合组Caveolin-1 mRNA表达增加量，且联合组与依折麦布30 μmol/L组和罗格列酮组比较，Caveolin-1 mRNA表达增加更为明显。详见表2。

表2 依折麦布联合罗格列酮对Caveolin-1 mRNA表达的影响(±s)

与空白对照组比较，①P<0.05；与泡沫细胞组比较， ②P<0.05；与依折麦布30 μmol/L组比较， ③P<0.05；与罗格列酮组比较， ④P<0.05。

3 讨 论

胆固醇的流出是指胆固醇从特定的通道由细胞内转运到细胞外进行代谢，胆固醇的逆转运可减少泡沫细胞的形成，从而减少脂质斑块的形成[6-7]。因此，减少细胞内蓄积的胆固醇对临床疾病治疗意义重大。大量研究显示，Caveolin-1在胆固醇的流出中发挥转运中心的关键作用。小凹是细胞外胆固醇流出主要通道，Caveolin-1是小凹的主要组成蛋白，对调节细胞信号传导、维持细胞内外的胆固醇平衡有重要的作用[1，8]。

罗格列酮是一种噻唑烷二酮类抗糖尿病药，通过提高胰岛素的敏感性而有效地控制血糖，其药理作用是通过过氧化物酶体增殖激活受体-γ(PPAR-γ)实现的[9-11]。PPAR-γ作为核受体超家族的一员，是一种脂质激活转录因子，PPAR-γ可诱导血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞中的Caveolin-1表达，以减缓动脉粥样硬化的进程[12]。本实验结果显示，罗格列酮可提高脂化后细胞内小凹蛋白的表达，说明对于动脉粥样硬化病人，罗格列酮本身具有延缓粥样斑块形成的作用。

临床研究表明，在他汀类药物治疗基础上进一步服用依折麦布可降低血脂水平[13-14]。依折麦布为一种选择性的胆固醇吸收抑制剂，可抑制小肠细胞刷状缘的尼曼-匹克蛋白活性，从而降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，其分子量小，能反复进行肝肠循环，主要抑制外源性的胆固醇以发挥降血脂的作用。研究发现，依折麦布通过激活平滑肌细胞表面的脂质激活转录因子，如LXRα、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)，上调Caveolin-1的表达，促进胆固醇流出，发挥抗动脉粥样硬化作用[8]。本实验证明应用依折麦布干预脂化后的细胞可增加小凹蛋白的产生。

目前在临床上，依折麦布仅用于降低血清胆固醇，虽然副作用较他汀类药少，但仍不是降血脂的首选药物，也并没有作为抗动脉粥样硬化的常规用药；而罗格列酮也只应用于控制血糖。依折麦布及罗格列酮均可使细胞内的胆固醇逆转运至细胞外，起到抗动脉粥样硬化的作用，且两种药物联合使用，增强了这种效用。这种作用关键点在于提高了细胞内小凹蛋白的表达，也并不排除两种药物作用于其他新的信号转导通路。这两种药物及联合使用后的作用还处于体外实验阶段，在临床上应用能否达到明显的抗动脉粥样硬化结果仍需进一步研究。