C反应蛋白基因单核苷酸多态性与缺血性脑卒中相关性的Meta分析

脑卒中发病率高，已成为我国致死的第一大病因，给社会、家庭带来了沉重的负担[1]。传统的危险因素诸如高血压病、糖尿病、肥胖、高同型半胱氨酸血症、吸烟及饮酒等仅能解释部分事件，因此，脑卒中发病机制目前尚未完全阐明。缺血性脑卒中(ischemic stroke， IS)作为卒中的常见亚型，是一种环境和遗传因素相互作用的多基因病[2-3]。在众多的IS候选基因中，C反应蛋白(C-reactive protein， CRP)作为一种参与动脉粥样硬化的炎性标记物[4]，与IS的发生[5-6]及预后[7]密切相关。大量流行病学资料和临床研究已经证实，CRP基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)与血浆CRP水平密切相关[8-9]。近年来，亦有多项研究报道认为CRP基因SNP与IS易感相关，如rs1800947、rs3093059。然而由于种群间异质性、单个研究统计效力的局限性等因素的影响，使得结果颇有争议。Chen等[10-11]研究认为rs1800947与IS的发生风险相关。Shen等[8]研究显示rs3093059与IS的易感性相关。Morita等[12]在日本人群中研究发现，rs1800947位点C等位基因与IS的发生相关。而Ladenvall 等[13]在瑞典人群、Das等[14]在印度人群证实了rs1800947多态性与IS无关。Chen等[15]研究显示rs3093059与IS的易感性无关。探究CRP 基因在IS发生中的具体作用机制，对于IS的预防、治疗及预后具有重要意义。基于此，通过收集CRP基因rs1800947、rs3093059位点多态性与IS相关性的病例对照研究，运用Meta分析的方法对既往研究结果进行综合定量评价，提高关联分析统计效力，进一步得出更为贴切的结论，以期为IS临床用药靶点和预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 文献纳入标准及排除标准 纳入标准：①国内外公开发表的关于CRP基因rs1800947(1059G>C)、rs3093059(-757T>C)多态性与IS相关性的文献；②病例对照研究；③IS的诊断符合全国第四届脑血管病学术会议修订的《脑卒中诊断标准》；④样本量明确，各基因型及等位基因数据可直接获得或通过数据计算获得；⑤对照组基因频率分布符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg eguilibrium，HWE)遗传平衡定律；⑥纳入文献若同时报道两个不同人群的研究结果，每个人群在Meta分析中将视为一个独立的研究报道。

排除标准：①非入选基因位点；②重复报道，文献质量差；③数据不完整或通过计算不能得出完整数据；④非病例对照研究。

1.2 纳入文献的检索流程与筛选 检索数据库包括：PubMed、MedLine、Springer、EMbase、OVID、Cochrane Library、中国期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、万方数据库(WanFang Data)、维普中文期刊数据库(VIP)中，检索时间自数据库建库至2020年1月1日。中文检索式：(脑卒中 OR 脑梗死 OR 脑中风) AND (C反应蛋白 OR CRP) AND (基因 OR 多态性)。英文检索式：(C reactive protein OR CRP) AND (ischemic stroke OR cerebral infarction OR cerebral ischemia)AND (polymorphism OR polymorphisms OR genotype OR genetic OR gene)。并通过手动检索文献的方式，追溯查找可能的相关文献。以PubMed为例，其具体检索策略为：

#1 C reactive protein

#2 CRP

#3 ischemic stroke

#4 cerebral infarction

#5 cerebral ischemia

#6 polymorphism

#7 polymorphisms

#8 genotype

#9 genetic

#10 gene

#11 (#1 OR #2) AND (#3 OR #4 OR #5) AND (#6 OR #7 OR #8 OR #9 OR #10)

1.3 文献筛选、资料提取及质量评价 本研究由两名研究者进行文献筛选，并进行交叉核对，不一致时进行讨论或提交至第三方解决。提取信息包括第一作者姓(名)、发表年份、病例组和对照组的人数、基因型及等位基因分布数据、实验方法、次要等位基因频率，对照组来源等。纳入文献质量采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)量表进行评价，以星级对病例组和对照组的选择、可比性以及危险因素的暴露情况进行评价，当评分≥6分为高质量文献。

1.4 研究效应测定指标 CRP基因SNP与IS发病风险关联采用以下3种模型。①显性效应模型：以野生型(WT)为对照，计算杂合型(HT)和突变型(MT)与IS风险关联程度；②隐性效应模型：以WT+HT为对照，计算MT与IS风险关联程度；③等位基因模型：rs1800947、rs3093059分别以G等位基因、T等位基因为对照，计算C等位基因与IS发病风险的关联程度。

1.5 统计学处理 采用Review Manager 5.1软件进行Meta分析。以比值比(odds ratio， OR)和95%置信区间(95%CI)作为每项研究结果的研究效应指标。采用Q检验评估研究间的异质性[16]，若存在显著异质性(P≤0.10，I2>50%)，则选用随机效应模型进行合并；若无显著异质性(P>0.10，I2<50%)，则选择固定效应模型进行合并。计算病例组和对照组 rs1800947位点显性模型(GG与GC+CC)、等位基因模型(G与C)，以及rs3093059显性模型 (TT与TC+CC)，隐性模型(TT+TC 与 CC)、等位基因模型(T与C)比较的合并OR值及95%CI。采取逐一排除的方法进行敏感性分析。应用STATA 10.0软件Egger检验进行发表偏倚评价。当P<0.05时，认为存在发表偏倚。

2 结 果

2.1 文献检索结果 本研究经初步数据库检索共获得相关文献157篇，经过逐层筛选，共纳入9篇[8-12，17-20]文献，其中陈声妹等[17]为两项研究，故最终共纳入10项研究。本研究纳入文献NOS量表评分均大于6分，提示纳入文献质量较好。文献筛选流程见图1。

图1 文献筛选流程图

2.2 纳入文献的基本特征(见表1)

表1 纳入文献的基本特征

注： PHWE为Hardy-Weinberg平衡检验；MAF为最小等位基因频率。

2.3 Meta分析

2.3.1 CRP基因rs1800947位点与IS的相关性 各研究rs1800947位点各基因型分布见表1。5篇文献比较了病例组和对照组rs1800947位点的频率分布差异[10-12，17-18]，其中陈声妹等[17]分别报道了海南籍黎族和汉族人群，故最终纳入6项研究，累计病例组721例，对照组1 043例。因rs1800947位点CC基因型频率较低，故仅对显性模型、等位基因模型进行研究。结果发现，各研究显性模型比较存在异质性(I2=66%，P=0.01)，故采用随机效应模型进行Meta分析，合并效应量差异有统计学意义[OR=1.30，95%CI(0.74，2.26)，P=0.36]。详见图2。各研究等位基因模型也存在异质性(I2=69%，P=0.007)，采用随机效应模型合并，结果显示[OR=1.25，95%CI(0.72，2.18)，P=0.42]。详见图3。

图2 两组rs1800947位点显性模型比较的Meta分析

图3 两组rs1800947位点等位基因模型比较的Meta分析

2.3.2 CRP基因rs3093059位点与IS的相关性 各研究rs3093059位点各基因型分布见表1。5篇文献比较了病例组和对照组rs3093059位点的频率分布差异[8-10，19-20]，累计病例组1 790例，对照组3 065例。显性模型各研究间比较无统计学异质性可接受(I2=23%，P=0.29)，采用固定效应模型分析，结果显示CRP基因rs3093059位点频率分布降低[OR=0.88， 95%CI(0.78，0.99)，P=0.04]。详见图4。隐性模型比较亦无统计学异质性(I2=11%，P=0.34)，采用固定效应模型进行分析，结果显示合并效应量无统计学意义[OR=1.09， 95%CI(0.77，1.55)，P=0.62]。详见图5。等位基因模型比较无统计学异质性(I2=38%，P=0.17)，采用固定效应模型分析，结果显示合并效应量无统计学意义[OR=0.91， 95%CI(0.82，1.02)，P=0.10]。详见图6。

图4 两组rs3093059位点显性模型比较的Meta分析

图5 两组rs3093059位点隐性模型比较的Meta分析

图6 两组rs3093059位点等位基因模型比较的Meta分析

2.4 敏感性分析

2.4.1 rs1800947位点敏感性分析 采用逐一排除的方法进行敏感性分析，发现剔除邓可等[11]研究后，两组显性模型比较结果发生反转。两组显性模型比较中，各研究无统计学异质性(I2=39%，P=0.16)，采用固定效应模型分析，结果OR=1.62，95%CI(1.16，2.28)，P=0.005。两组等位基因模型比较，各研究存在统计学异质性(I2=51%，P=0.09)，采用随机效应模型分析，OR=1.54，95%CI(0.96，2.46)，P=0.07。

2.4.2 rs3093059位点敏感性分析 采用逐一排除的方法进行敏感性分析，结果均未发生方向性变化，提示结果稳定性较好。

2.5 发表偏倚评估 采用STATA 10.0软件对发表偏倚进行评价。rs1800947位点、rs3093059位点显性模型、隐性模型、等位基因模型进行Egger检验。结果提示各模型发表偏倚对结果影响较小(P>0.05)。详见表2。

表2 CRP基因rs1800947和rs3093059发表偏移的Egger检验

3 讨 论

研究表明，CRP作为动脉粥样硬化的炎性反应标志物，与IS的发生密切相关[4-5]。CRP基因位于1q 21～1q23，基因组全长2.3 kb，包括1个内含子和2个外显子，共编码206个氨基酸。既往研究证实血CRP水平受遗传因素的影响可达22%～56%[21-22]。其中，rs1800947G>C是位于第2外显子的一个氨基酸同义变异，可能调节蛋白质表达量的改变导致疾病发生。而rs3093059T>C位于启动子区，其可能在一定程度上调控CRP基因的表达，二者均突变频率较高。既往研究已证实，二者等位基因突变可影响血压及CRP水平，且与颈动脉粥样硬化的关系密切[23-24]。

本研究纳入的10项研究，CRP基因rs1800947、rs3093059与IS的相关性结果并不一致。部分研究认为突变基因型增加IS易感性[10，12，17]，部分研究认为与IS发生无关[5，9，10，17，20]，甚至部分文献报道可降低IS的易感性[8，11，19]。各研究种族、对照来源、分子生物学技术、人群暴露因素等存在差异，可能导致文献间出现异质性。因此，CRP基因多态性与IS发生的关系仍是困扰研究人员的难题。

本研究涉及rs1800947位点包含6项研究，共纳入病例组721例，对照组1 043例，纳入研究结果间存在较大的异质性，结果仅能表明亚洲人群，尤其中国人群rs1800947多态性与IS易感性不相关。而Chen等[10]、Morita等[12]认为rs1800947位点C等位基因可增加IS的易感性，邓可等[11]认为C等位基因可降低IS易感性，与本研究结果不同。通过敏感性分析，剔除邓可等[11]研究后，各研究间异质性变小，两组显性模型、等位基因模型比较结果发生反转。各研究结论的不一致以及本次Meta结果的不稳定性可能仍与目前研究较少有关，虽Egger检验无显著发表偏移，但仍需要以后开展更多关于CRP基因rs1800947多态性与IS易感性的研究来证实两者关系。本研究结论与国外Ladenvall等[13]、与Kuhlenbaeumer等[25]研究结论一致。Ladenvall 等[13]为一项瑞典人群病例对照研究，纳入600例IS病人和600例匹配的对照人群，证实rs1800947与IS无关。Kuhlenbaeumer等[25]为德国人群病例对照研究，纳入了1 699例IS卒中病人和1 432例对照人群，虽证实rs1800947与IS亚型(小动脉闭塞型卒中)发生密切相关，但与整体IS发生无关。以上两项研究因数据无法获得，遗憾未纳入本次Meta分析。

本研究对CRP基因rs3093059多态性与IS发生的相关性共纳入5项研究，病例组1 790例，对照组3 065例，均为中国人群，显性模型研究发现(TC+CC)基因型与IS易感性呈负相关，而隐性模型与等位基因模型分析得出阴性结论。纳入研究结果间显性模型异质性小，采用逐一排除的方法进行敏感性分析，结果均未发生方向性变化，提示结果稳定性较好。本次分析结果表明，中国人群携带CRP基因rs3093059位点携带(TC+CC)基因型较TT基因型IS易感性下降。通过Egger检验对发表偏倚进行定量分析后，发现rs3093059各模型均无明显发表偏移，提示结果可信。但由于本研究纳入文献数较少，部分程度上可能影响结论的可信度。

本研究亦存在一定的局限性。首先，本研究纳入文献均为病例-对照研究，无法避免在人群来源、分配和实施等阶段带来的偏倚风险；其次，本研究纳入研究数量少，未能从亚组分析探讨异质性来源，可能会影响结果的准确性；最后，纳入人群几乎为中国人群，尚需扩大检索范围，补充全球有关CRP基因与IS关联的研究，进一步增强研究对象的代表性、研究结果的科学性。

综上所述，本研究表明CRP基因rs1800947位点与IS的发病风险不相关，而人群rs3093059位点携带(TC+CC)基因型较TT基因型IS易感性下降，为初步确定IS易感人群提供了部分客观的循证医学证据。由于受纳入研究数量的限制，上述研究结论尚待更多高质量研究予以验证。基于此，需要在以后的研究中统一方法，充分考虑研究种族、对照来源、环境暴露等因素，以增强各研究的科学性及可比性。