基于网络药理学探究川芎-黄连药对改善动脉粥样硬化的作用机制

赵艺涵1，赖润民1，史大卓，张 莹

动脉粥样硬化导致的心脑血管疾病是我国乃至全球范围内位居前列的死亡原因[1]。动脉粥样硬化早期无症状，但随着病变逐步进展斑块可堵塞管腔，甚至破裂形成血栓，进一步导致严重临床事件的发生，如急性心肌梗死或脑卒中。动脉粥样硬化的病理变化十分复杂[2]，在动脉粥样硬化早期，富含胆固醇的低密度脂蛋白-胆固醇沉积于血管壁并被氧化修饰，损伤血管内皮细胞，活化的血管内皮细胞进一步表达黏附分子，使巨噬细胞、T细胞于病变处聚集。巨噬细胞吞噬氧化脂质后形成泡沫细胞，泡沫细胞死亡裂解后形成纤维帽。晚期不稳定斑块破裂后形成血栓阻塞管腔。

中医学将动脉粥样硬化的病因病机归于“血脉瘀阻”的范畴，但经多年的临床实践与观察发现血瘀病因不能全面概括心血管疾病发生发展出现的组织坏死、氧化应激损伤、炎症反应等改变，因此，陈可冀院士提出了“毒邪致病”的学说。在此理论指导下，已有基础研究证明活血解毒中药有效成分具有稳定动脉粥样硬化斑块、抑制炎症等作用[3-4]，在临床上也形成了行之有效的活血、化瘀、解毒治则治法。活血化瘀药川芎与清热解毒药黄连联用是常见的活血解毒药对，基础研究已证实单用川芎或黄连活性成分具有明确的抗动脉粥样硬化效果[5-8]。

网络药理是采用“网状目标、多组分、多通路”的新模式来探究中药可能靶点的方法。网络药理学从整体出发，采用生物信息学手段构建不同层次的节点网络，从而在分子层面系统性预测中药及复方活性成分和作用靶点[9]。本研究采用网络药理学方法筛选出川芎、黄连中的活性成分，进一步发掘其改善动脉粥样硬化靶点，可为阐释川芎-黄连药对改善动脉粥样硬化机制提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 黄连、川芎活性成分的收集与筛选 利用TCMSP平台收集川芎及黄连的所有化学成分，筛选出药物相似性(drug likeness，DL)>0.18[10]、口服生物利用度(oral bioavailablitity，OB)>30%[11]的化学成分作为候选药物成分。并根据文献补充以下川芎活性成分[5-6，12-15 ]：Tetramethylpyrazine，Ligustilide，Senkyunolide A，Senkyunolide G，Butylphthalide，Ferulic acid。进一步利用PubChem数据库对TCMSP数据库筛选出的活性分子进行结构辨别，确定2D、3D结构及简化分子线性输入规范(simplified molecular input line entry specification，SMILES)。

1.2 川芎-黄连作用靶点的收集与预测 Swiss Target Prediction数据库[16]可基于待测分子的2D及3D结构与已知配体的相似度，通过交叉验证和分析排列从而预测作用靶点。将经1.1筛选得到的黄连-川芎药对结构式导入SwissTarget数据库，限定研究物种为人(homo sapiens)查找靶点，使靶点蛋白质名称、靶点基因名称与Uniprot ID一一对应。利用网络可视化软件Cytoscape3.7.0构建川芎-黄连药对的活性成分-作用靶点网络。

1.3 动脉粥样硬化疾病靶点预测及相关网络构建 利用GeneCards数据库获取与动脉粥样硬化相关的基因靶点，导入UniProt数据库经名称-ID配对获得相关基因靶点的UniProt ID，并在Cytoscape中构建动脉粥样硬化的疾病-靶点网络。

1.4 药物-活性成分-靶点-疾病的网络构建与分析 将川芎-黄连药对的主要活性成分-靶点网络与动脉粥样硬化疾病靶点网络在Cytoscape中取交集，从而获得药物-活性成分-靶点-疾病网络。

1.5 相关靶点基因分析与通路分析 利用FunRich软件[17]对靶点基因进行GO(gene ontology)生物学过程、细胞组分及分子功能的富集分析，使用Cytoscape的Clue Go插件[18]进行KEGG通路分析，并对P值进行校正，设定P<0.05，筛选出具有统计学意义的生物学过程和信号通路。

2 结 果

2.1 川芎-黄连活性成分和作用靶点筛选 通过TCMSP数据库进行OB及DL筛选，并且与PubChem数据库对照确定分子式，共得到27种候选药物成分，其中13种成分来源于川芎，14种来源于黄连。利用Swiss Target查找此27个主要活性成分可能的作用靶点，将27个主要活性成分及对应靶点基因导入Cytoscape中，获得主要活性成分-作用靶点网络。详见表1。

表1 川芎-黄连药对的27种活性成分

(续表)

TCMSP编号 活性成分OB(%)DL来源PubChem CIDMOL002157Wallichilide42.310.71川芎10873344MOL002151Senkyunone47.660.24川芎91726743MOL002140Perlolyrine65.950.27川芎160179MOL002122Z-Ligustilide53.720.07川芎5319022MOL0021814-hydroxy-3-butylphthalide70.310.08川芎11074544MOL002208Senkyunolide A26.560.07川芎3085257MOL002202Tetramethylpyrazine20.010.03川芎14296MOL002209Senkyunolide G39.520.08川芎10013283MOL001454Berberine36.860.78黄连2353MOL002903(R)-Canadine55.370.77黄连443422MOL002894Berberrubine35.740.73黄连72704MOL002904Berlambine36.680.82黄连11066MOL001458Coptisine30.670.86黄连72322MOL002907Corchoroside A aglycon104.950.78黄连6185MOL002897Epiberberine43.090.78黄连160876MOL008647Moupinamide86.710.26黄连5280537MOL013352Obacunone43.290.77黄连119041MOL000622Magnograndiolide63.710.19黄连5319198MOL000785Palmatine64.600.65黄连19009MOL000762Palmidin A35.360.65黄连5320384MOL000098Quercetin46.430.28黄连5280343MOL002668Worenine45.830.87黄连20055073

2.2 川芎-黄连改善动脉粥样硬化相关靶点筛选 GeneCards数据库中收集到动脉粥样硬化相关基因3 152个，将基因名称导入UniProt数据库，经名称Uniprot ID配对后获得相关ID 3 121个，导入Cytoscape中，建立疾病-靶点网络。将主要活性成分-作用靶点网络及疾病-作用靶点网络取交集，得到川芎-黄连改善动脉粥样硬化的作用靶点170个。将靶点名称及相应的度值导出，并据度值大小按降序，排序将前50位绘制成表格。详见表2。

表2 川芎-黄连改善动脉粥样硬化潜在作用靶点(前50位)

(续表)

Uniprot IDGeneCards度值Uniprot IDGeneCards度值Q99720SIGMAR15P35372OPRM12P41595HTR2B5P07451CA32P28335HTR2C5O43570CA122P23975SLC6A25P08908HTR1A2P51589CYP2J24P34972CNR22O15296ALOX15B4P21554CNR12

2.3 川芎-黄连活性成分-动脉粥样硬化-作用靶点网络分析 将Cytoscape中得到的药物活性成分-疾病-靶点网络结果导出，川芎-黄连药对中的27个主要活性成分与动脉粥样硬化相关基因中的170个基因之间存在397条关联。经网络分析可知药物-活性成分-疾病-作用靶点网络共包括197个节点，397条边，橙色节点代表黄连活性成分，红色节点代表川芎活性成分，蓝色节点代表靶点基因。节点图标大小与节点相对应的度的大小成正比，图中节点越大则表示该节点的度越大，可能在网络中起着枢纽作用。据网络分析结果可知1个活性成分可以作用于多个靶点，1个靶点也可以与多个活性成分发生作用；纳入网络分析的所有活性成分的度值≥8，而度的数值位于前列的靶点基因则有MBNL1、BCHE、ACHE、CHRM1、CHRM4、MBNL3、MBNL2。详见图1。

图1川芎-黄连活性成分-动脉粥样硬化-作用靶点网络

2.4 作用靶点的生物学过程及信号通路富集分析 利用Funrich软件进行Go分析，选取P<0.05且与动脉粥样硬化相关的生物学过程，按照P值升序排序整理成图2。详见图2。结果显示相关生物学过程主要涉及G 蛋白偶联受体介导的信号通路、碳酸氢盐转运、脂氧合酶途径、多不饱和脂肪酸生物合成途径、氧化还原进程等。利用Cytoscape的Clue Go插件进行KEGG通路分析，选取P<0.05的结果，通过在KEGG数据库中查找信号通路信息获得与动脉粥样硬化相关的通路16条整理成表，并按照相关生物过程简单分为信号转导、内分泌系统、消化系统及排泄系统4大类。其中富集程度高且富集基因数量较多的通路主要集中于信号转导方面，包括神经配体-受体相互作用信号通路、钙离子信号通路、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路等。详见表3。

图2 川芎-黄连药对改善动脉粥样硬化潜在靶点的生物学进程

3 讨 论

迄今为止，动脉粥样硬化的具体发病机制尚未完全阐明，但公认的危险因素包括血脂异常、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖和代谢综合征等[19]。活血解毒药对川芎-黄连配伍基于陈可冀院士“活血解毒”治疗心血管疾病的基本思路，属于协同增效的现代药对。通过构建川芎-黄连药对改善动脉粥样硬化的药物-活性成分-靶点-疾病网络，发现27个活性成分可作用于170个靶点基因，证实中药具有多途径、多靶点、协同作用的机制。GO分析显示生物学过程主要包括G 蛋白偶联受体介导的信号通路、碳酸氢盐转运、脂氧合酶途径、多不饱和脂肪酸生物合成途径、氧化还原进程等，KEGG分析涉及的信号通路则与信号转导、内分泌系统、消化系统与排泄系统4类过程相关，因此，川芎-黄连药对有着通过上述机制改善动脉粥样硬化的可能性。

就动脉粥样硬化病理过程而言，炎症反应贯穿于动脉粥样硬化过程始终，在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。MAPK信号通路参与炎症反应的调控与动脉粥样硬化早期炎症反应，对于血小板活化过程也有着影响。基础研究已经证实p38MAPK通路与血管内皮细胞损伤密切相关[20]。黄连有效成分及川芎有效成分分别通过MAPK信号通路减小斑块面积以提升斑块稳定性均已有研究报道[5，7]，这与本KEGG分析结果显示川芎-黄连药对通过MAPK信号通路发挥抗炎、抗动脉粥样硬化作用的结果有着一致性。血栓形成是动脉粥样硬化发展恶化的重要过程之一，90%的急性冠脉综合征来源于斑块破裂后的血栓形成[19]。血小板的活化及后续炎症反应则离不开血小板自身存在的信号转导机制，其中嘌呤能受体P2Y12及P2Y1在血小板活化和动脉粥样硬化进展中起着关键作用，具体机制为二磷酸腺苷(ADP)与血小板膜上的ADP受体P2Y1或P2Y12结合，通过G蛋白偶联受体介导的信号转导通路发生血小板活化作用。P2Y1与Gq蛋白结合，激活下游的磷脂酶C，促进胞浆内钙离子释放，引起血小板聚集。P2Y12偶联G蛋白，抑制腺苷酸环化酶，降低cAMP含量，激活下游PIK3/Akt蛋白通路从而引起纤维蛋白原受体激活及扩增血小板聚集反应[21-22]。现有ADP受体/P2Y12抑制剂如氯吡格雷、替格瑞洛已广泛应用于临床。据网络药理学分析结果可知钙离子信号通路、cAMP信号通路可能是川芎-黄连改善动脉粥样硬化的作用靶点通路，而生物学进程则包括G蛋白受体偶联的信号转导通路，这与既往川芎与黄连的有效成分联用可抑制急性心肌梗死大鼠模型ADP诱导的血小板聚集[23]的报道相一致，为川芎-黄连这一现代活血解毒药对改善动脉粥样硬化的机制提供了新的思路。

糖尿病是动脉粥样硬化的重要危险因素之一，急性冠状动脉事件在糖尿病病人中的发生概率是正常人的3～5倍[19]。据KEGG分析可知川芎-黄连可能有着调节胰岛素分泌、减轻胰岛素抵抗的作用。黄连素对于糖尿病和胰岛素抵抗大鼠有提升糖耐量、升高胰岛素、降低三酰甘油作用[24]。高血压可损伤血管内膜，增加血管壁对脂蛋白的通透性及造成血流动力学异常，加速冠状动脉粥样硬化进程[19]。醛固酮可进行钠离子及水分的重吸收从而调节血容量，在血压调节中起着至关重要的作用。现有报道显示川芎有效成分或黄连有效成分单用可降低血浆醛固酮水平、调节血压、抑制心肌纤维化进程[25-26]。由KEGG分析结果可知川芎-黄连可能有干预醛固酮调节的钠离子重吸收、调节醛固酮合成与分泌的作用，从而控制血压、改善动脉粥样硬化。

本研究通过网络药理学阐释了川芎-黄连改善动脉粥样硬化的可能机制，为后续研究提供了新思路，但仍需进一步从动物或细胞水平验证才能揭示其防治疾病的作用机制。