基因芯片技术在自然流产胚胎染色体分析中的应用

余勤俭，孙素玉，沈旭娜，徐雪琴，唐少华，周媛萍

(1. 温州市中心医院 妇产科，浙江 温州 325000；2.湖州市妇幼保健院 妇产科，浙江 湖州313000)

造成自然流产的原因众多，有研究[1]表明，超过50%的自然流产是由胚胎染色体异常引起。目前临床对胚胎染色体分析的金标准为染色体核型分析技术，但染色体核型分析技术诊断周期长且易受标本陈旧、污染等多种因素影响。基因芯片单核苷酸多态性阵列(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)是含有大量SNP位点序列的高密度基因芯片，由原位合成在硅材料上的大量特定寡聚核苷酸(探针)组成，将待测核酸样本处理后与芯片上的探针按照碱基互补配对原则进行杂交。采用激光共聚焦扫描经染色、信号放大处理后的杂交芯片采集荧光信号，对每个点的荧光强度进行数字化分析，判断对应片段或位点是否有扩增或缺失，可实现核酸分子高通量检测和分析[2]。Affymetrix公司基因芯片对人类基因组的分布密度为1 marker/4 kb，芯片包含550 000 CNV标记及200 000 SNP标记。本研究采用Affymetrix公司基因芯片技术对自然流产患者胚胎组织进行全基因组染色体检测，旨在探讨该基因芯片技术在临床染色体分析中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月—2017年6月温州市中心医院收治的70例早期自然流产患者为研究对象，所选患者均经B超检测胚胎停止发育或胎心、胎芽消失。所选患者年龄21～42岁，平均(31.0±3.6) 岁；孕周7～12周，平均(9.2±0.9) 周；孕次1～3次，平均(1.7±0.6) 次。本研究经温州市中心医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 基因芯片检测 无菌条件下，采用DNA提取试剂盒(QIAGEN 51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，美国QIAGEN公司)提取流产胚胎组织基因组DNA，按照试剂盒说明书步骤提取。采用Affymetrix公司的基因芯片(Affymertrix GeneChip 750K SNP)进行全基因组染色体检测，操作方法：提取的基因组DNA溶解于AE 缓冲液，调整浓度至50 ng/μL，用Nsp I限制内切酶进行处理。运用T4连接酶将Nsp I接头连接至Nsp I酶切产物上，然后以Nsp I酶切产物为模板进行PCR扩增，1份Nsp I酶切产物做4个PCR扩增反应，扩增片段为150～2 000 bp。扩增的4份PCR产物进行磁珠法混合纯化后，用52 μL洗脱液进行洗脱。取2 μL进行浓度测定，45 μL加入5 μL稀释的片段化试剂进行PCR片段化程度，片段化产物在25～125 bp内。片段化产物在脱氧核糖转移酶的作用下进行标记反应后，置入芯片与混合纯化液进行杂交变性，杂交时间为16～18 h，温度50℃。杂交完成后将芯片进行洗涤、染色，最后进行芯片扫描。

1.3 数据分析 采用Affymetrix公司研发的染色体分析软件进行数据分析，染色体异常包括染色体数目异常以及结构异常。数目异常主要为非整倍体以及多倍体，结构异常为染色体拷贝数目变异(CNV)，CNV判断标准为缺失片段大于400 kb，重复片段大于1 Mb[3]。

1.4 临床评价标准 采用美国医学遗传协会制定的CNV诊断专业指南[4]进行CNV结果的临床评价。①良性CNV指在多个已有的文献或数据库资料中均报道为良性变异；②致病CNV指在既往相关文献、数据库中已经明确为致病变异；③致病意义不明CNV指在报告时无法找出明确证据来明确检测到的CNV 的临床意义，或所检测到的CNV不符合报告标准。

2 结果

2.1 染色体异常情况 基因芯片技术检测70例早期自然流产胚胎组织基因，21例正常，49例异常，异常检出率为70.0%。49例异常中38例为染色体数目异常，11例为染色体结构异常。

2.2 染色体数目异常 38例染色体数目异常中，三倍体4例，非整倍体34例。6例染色单体(45, XO)，2例2-三体，2例3-三体，2例4-三体，1例7-三体，1例8-三体，1例15-三体，10例16-三体，1例17-三体，1例18-三体，3例21-三体，2例22-三体，1例48，XX，+7，+21，1例50，XX，+13,+18,+19,+21。

2.3 染色体结构异常 11例染色体结构异常中，1条染色体异常为微缺失或微重复有10例，染色体结构复杂异常即多条染色体结构改变1例。具体染色体核型见表1。

表1 染色体结构异常及核型

3 讨论

超过35岁且有过流产史女性中，染色体异常导致流产的风险达75%以上[5-6]。本研究中70例自然流产的染色体异常率为70.0%。本研究中，染色体异常主要包括染色体多倍体、单体、三体以及染色体结构异常等，38例染色体数目异常中，三倍体4例，非整倍体34例，其中染色单体(45, XO)6例，与既往研究[7]结果相符合。11例染色体结构异常中，10例出现微缺失或微重复，1例为染色体结构复杂异常。查阅11例结构异常染色体所对应的核型，发现部分染色体拷贝数目变异与身材矮小、发育迟缓、智力障碍以及器官畸形等有关，是否与自然流产有关还需扩大样本量进一步研究；部分染色体拷贝数目变异显示为致病意义不明，需对其父母的染色体进行检测，判断是否与双亲遗传有关[8-9]，如遗传自父母，大部分为良性多态性改变；如为突变，可能为存在临床意义的CNV[10-11]。

流产遗传学检测结果不仅可解释该次流产的具体原因，同时可为下次妊娠提供具体建议[12-13]。如检测结果为非整倍体，则大多为偶发性，下次妊娠选择合适的产前诊断可获得良好预后；若为正常染色体或染色体多态性导致的流产，则需找寻其他原因；若为致病意义不明确的染色体拷贝异常，则需检测是否为双亲遗传等。基因芯片技术运用于流产胚胎及胎儿染色体检测具有如下优势[14-15]：①分辨率高，可检出小于5 Mb的CNV；②准确性高，可避免培养中出现染色体突变以及母体细胞选择性生长等情况；③检出率高；④检测速度快。基因芯片技术也存在着不足，如基因芯片技术无法检测染色体的插入、倒位、平衡易位以及低比例嵌合，对致病意义不明的染色体拷贝异常无法明确其临床意义[16-17]。本研究11例染色体结构异常中，一条染色体异常为微缺失或微重复有10例，小于5 Mb的CNV有6例，最小的为1.04 Mb，优于传统核型分析技术水平。

综上，基因芯片技术对自然流产患者胚胎组织的全基因组染色体分析具有准确性高、检出率高的特点，在流产病因解释、遗传咨询、产前诊断、再次生育指导等方面具有临床应用的价值。