基因芯片快速检验细菌的临床应用

许俊钢

【摘要】 目的 应用基因芯片对临床常见致病细菌进行检测。方法 选取4种临床常见的致病细菌， 包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌， 应用VereFoodborne Detection chip 芯片对所选细菌进行检测。结果 对临床30份标本进行检测， 均得到准确的检测结果。全部细菌检测均在8 h内完成， 较临床常规检测方法平均缩短1/3时间， 其中部分血液感染标本检测时间更是从原来的3～5 d缩短至1 d完成， 检测效率大大提高。结论 基因芯片检测系统能准确、快速地对目的细菌做出检测， 是细菌快速检测的发展方向。

【关键词】 基因芯片；致病菌；检测

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.020

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌是临床常见的致病菌。针对临床常见的细菌感染， 目前临床多采用常规培养方法进行细菌检测。随着分子生物学的发展， PCR、荧光定量PCR等方法纷纷引入临床微生物检验中[1]， 不同于传统的培养方法， 分子诊断技术在保证准确性的同时， 有较强的特异性， 能够更快速地提供检测结果。本研究应用成熟的基因芯片检测系统， 为基因芯片在临床微生物检验中的应用奠定了一定的基础。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌为郑州大学附属洛阳中心医院检验科细菌室培养法确定菌株（共30份）。其中血液标本16份， 痰标本6份， 粪便标本8份， 提取细菌DNA后应用VereFoodborne Detection chip 芯片进行检验。

1. 2 粪便细菌DNA的抽提 采用DNA提取试剂盒“QIAamp DNA Mini Kit”， 严格按照说明书进行操作提取细菌DNA。

1. 3 细菌DNA的提取与PCR扩增 选择煮沸法提取细菌DNA， 大致方法是取1 ml无菌生理盐水落于1～2个血琼脂平板上过夜培养， 温度设置为37℃， 连续培养12 h， 加入50 μl DNA裂解液高温煮沸10～15 min， 然后离心（12000 rpm）5 min， 抽取长清液冷藏于-20℃下。对提取的细菌DNA样本进行PCR扩增， 扩增体系为50 μl， 94℃初变性30 s， 52℃退火45 s， 72℃延伸60 s， 95℃10 min。前后共35个循环， 72℃延伸8 min。

1. 4 探针的设计 本研究涉及的全部菌株均进行测序对比验证。参考有关研究， 基于革兰阳性菌和阴性菌的通用检测探针， 将标记为Cy3的20 T探针作为阳性探针， 稀释液作为阴性对照点布于芯片周围。

1. 5 芯片制备 探针取上海生工生物技术有限公司， 采用Arrayit-SpotBot 3点样仪点样， 每个检测位点平行点样3次， 点完后室温避光放置12 h（或置60℃烤箱中固定2 h）， 并固定于NC膜上。

1. 6 细菌DNA的芯片检测 细菌DNA抽提后应用意法半导体公司Veredus 快速侦检系统对细菌DNA进行检测。

2 结果

对30份标本进行检测， 其结果与目标细菌一致。全部细菌检测均在8 h内完成， 较临床常规检测方法平均缩短1/3时间， 其中部分血液感染标本检测时间更是从原来的3～5 d缩短至1 d完成， 检测效率大大提高， 这有助于为及时抢救、治疗赢得时间。

3 讨论

基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列（microarray）， 是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列， 其基本原理是通过杂交检测信息。基因芯片是分子生物学和微电子学及信息学相互结合所形成的新型技术， 利用基因芯片， 可以实现基因信息的大规模检测[2-4]。基因芯片技术是以基因序列为分析对象的生物芯片， 是技术最成熟， 且已实现商用的芯片检测技术。该技术的核心是集成处理， 即将探针集成于同一基片上， 通过检测杂交信号以实现对巨量基因信息的检测分析， 而其具体工作原理是通过在载体上按特定布阵固定分子探针， 以PCR和分子杂交为基础实现对目的基因的快速、有效地检测， 这样不仅显著提高了检测结果的准确性， 还大大提高了检测效率， 尤其是在感染性疾病的高发以及复杂性加剧的背景下， 微生物快速检测的强度和难度也越来越大， 单单依赖于细菌分离培养已远远无法满足临床的需求， 而基因芯片技术具有的检测高效、范围广等优点， 使其在病原菌快速检测领域的优势越来越突出， 随之在基因序列分析、抗感染药物研制等上下关联领域也有着越发广阔的应用前景[5]。

本研究结果显示， 全部细菌检测均在8 h内完成， 较临床常规检测方法平均缩短1/3时间， 其中部分血液感染标本检测时间更是从原来的3～5 d缩短至1 d完成， 检测效率大大提高， 这有助于为及时抢救、治疗赢得时间。

基因芯片技术经过20年的发展已经形成了一个系统的平台， 从样品制备、芯片制作、芯片杂交、数据扫描到后期的数据管理、储存以及深度数据挖掘都有了标准化的流程。目前商业化的基因芯片， 芯片设计上探针与待检测的目标序列片段互补， 具有完全的互补性；从而既有较高的敏感性， 也有较高的特异性， 仅对特定目标序列片段敏感， 对其他序列不产生杂交信号， 通过探针设计， 提高基因芯片检测的容错性、可靠性， 在基因芯片上设置质量监控探针， 以便于监控基因芯片产品的质量稳定性；通过探针布局， 使得最终的杂交检测图像便于观察理解[6]， 质量稳定性好， 可重复性强。

从本研究结果来看， 基于基因芯片技术的快速检测系统检测结果与目标细菌一致， 说明检测准确率令人满意。实际上， 随着基因芯片技术的进一步发展， 诸如玻璃芯片、液相芯片、模芯片等模式正在大大丰富基因芯片在细菌检测中的应用范围。不过， 基因芯片技术检测细菌也存在一定的局限， 如无法精确地提供涉及细菌毒力、耐药等信息， 且受细菌杂交影响大。不过， 随着分子生物学、半导体微电子技术等基因技术相关学科的发展， 更为综合性和标准化的基因芯片技术开始出现， 如利用多重PCR与芯片技术相结合的DNA芯片， 可同时检测8种生物恐怖相关的病原菌， 且精确率高， 大大提高了检测效率。此外， 本研究过程中还发现基因芯片在检测扫描结束后， 其呈现的荧光信号强度随着时间的延长而出现一定的衰减， 而背景信号强度则逐渐增强。不过， 时间延长至60 d观察， 信号强度受SNR值影响微小， 判断结果基本不受干扰， 从这个角度上说， 检测完毕后芯片可实现长期的留存， 便于复检。不过， 许多新的技术仍处于试验阶段， 相信未来随着基因芯片技术的进一步成熟， 其应用范围将扩展到微生物诊断、环境监测、生物危害防治等领域， 大大拓宽基因芯片技术的边界。

参考文献

[1] Muldrew KL. Molecular diagnostics of infectious diseases. Curr Opin Pediatr， 2009， 21（1）：102-111.

[2] Ramsay G. DNA chip： state-of-the art. Nat Biotechnol， 1998， 16（1）： 40-44.

[3] Chee M， Yang R， Hubbel E， et al. Accessing genetic information with high-density DNA array. Science， 1996， 274（5287）：610-614.

[4] Marshall A， Hodgson J. DNA chip： an array of possibilities. Nat Biotechnol， 1998， 16（1）：27-31.

[5] 张春秀， 肖华胜 .基因芯片技术的发展和应用. 生物产业技术， 2010， 3（5）：75-80.

[6] 孙啸， 王晔， 何农跃， 等 .生物信息学在基因芯片中的应用.生物物理学报， 2001， 17（1）：27-33.

[收稿日期：2015-07-10]