LAMP联合基因芯片技术在肺炎衣原体检测中的应用

翁琳+杨俊发+柴晓宇+许飞

[摘要] 目的 开发一种可以快速、准确检测肺炎衣原体的检测方法。 方法 采用环介导等温核酸扩增技术（LAMP）对肺炎衣原体的特异性DNA保守片段进行扩增，将扩增的DNA与基因芯片进行杂交，观察是否可在芯片相应的区域出现杂交信号。 结果 只有肺炎衣原体DNA经LAMP反应后出现特异性的扩增条带，经LAMP扩增后的产物与基因芯片杂交，仅肺炎衣原体区域出现杂交信号。 结论 LAMP技术联合基因芯片技术具有高度敏感性、高度特异性的特点，可快速准确地检测肺炎衣原体。

[关键词] 环介导等温核酸扩增技术；基因芯片；肺炎衣原体；杂交

[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（c）-0004-03

Application of LAMP combined with gene chip technology in detection of Chlamydia pneumoniae

WENG Lin1 YANG Jun-fa2 CHAI Xiao-yu2 XU Fei3▲

1.The Second People′s Hospital of Yichun City in Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Medical College of Nanchang University，Nanchang 336000，China；3.Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 336000，China

[Abstract] Objective To invent a rapid and accurate method to detect Chlamydia pneumonia（CP）. Methods The specific DNA conservative segment of CP was amplified by using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）.The amplified DNA and gene chip were hybridized.Whether the hybridization signal appearing or not in the corresponding region of the chip was observed. Results Only the amplified CP-DNA by LAMP appeared the specific amplification bands.After the LAMP sequence was hybridized with gene chip，only in the CP area appeared corresponding hybridization signal. Conclusion LAMP combined with gene chip technology have characteristics of high sensitivity，high specificity，can detect CP quickly and accurately.

[Key words] Loop-mediated isothermal amplification；Gene chip；Chlamydia pneumoniae；Hybridization

肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，CP）是社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的一种致病菌，年老体弱、免疫力低下者容易感染，且易反复，不易控制。随着我国老龄化的日益严重，CP所致肺炎的发病率及死亡率有上升趋势。早期明确诊断病原菌非常重要，但现阶段临床上对于CP的检测还相对滞后，本研究旨在开发一种可以快速、准确检测CP的方法。环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新的核酸扩增方法，具有简便、快速、高特异性好等优点[1-4]。基因芯片杂交技术能在面积较小的载体上同时检测多种病原菌，具有快速、准确、高通量等优点[5-6]。本研究采用LAMP技术对CP的靶基因进行扩增，后将扩展产物与基因芯片杂交，从而实现对CP的特异性检测。

1 资料与方法

1.1 菌种标准DNA来源

CP-DNA由南昌大学第一附属医院呼吸内科研究室自行制备及保存，而金黄色葡萄球菌、志贺菌、普通变形杆菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、枯草杆菌、沙门菌DNA均购买于北京美莱博医学科技有限公司。

1.2 主要试剂、仪器

试剂：2×PCR TaqMix（Tiangen Biotech）、BstDNA聚合酶（New England Biolabs公司）、引物（上海生工生物有限公司）、抽提液、杂交缓冲液、显色液、DNA Marker 500 bp。仪器：PCR仪（Biometra）、点样仪（Omni Grid100）、电泳仪（Bio Rad公司）、紫外成像系统（Alphalmager EC）、共聚焦激光扫描仪（Gene Pix 4000B）。

1.3 引物及探针的设计与合成

根据GenBank公布的CP特异性基因片段——ompA基因，并依据此基因片段设计合理的引物和探针。引物及探针均购于上海生工生物工程有限公司，CP的特异引物序列见表1。

表1 CP的LAMP特异性引物序列

1.4 芯片制备

基因芯片由上海芯片国家工程研究中心点制（图1），其检测原理是利用上述合成的探针与荧光标记的靶基因杂交，然后根据杂交信号强弱评判结果的一种定性检测。先将上述合成的探针稀释调整浓度至30 μmol/L，使用醛基化玻片进行点样，将每个样品点成4×4的矩阵，每个芯片上可以容纳32个矩阵，点制好的芯片置于干燥箱中保存备用。阳性对照选用Poly（T）-Biotin，探针稀释液为空白对照组，无同源性的酵母基因为阴性对照。

图1 探针点样示意图

M.肺炎支原体；C.CP；L.嗜肺军团菌；P.阳性对照；N.阴性对照；B.空白对照

1.5 LAMP扩增及反应产物的检测

先将F3 4 μl、B3 4 μl、FIP 16 μl、BIP 16 μl、ddH2O 50 μl混合均匀配制CP引物，在各PCR管中加入CP引物（1 μl）、模板DNA（2 μl）、ddH2O（6.2 μl）、Bst酶（0.8 μl）混和均匀后置于PCR仪中，温度设置为80℃，时间为10 min。将LAMP反应产物置于离心机中以12 000 r/min速度离心1 min，后将沉淀产物放入1.5%琼脂糖凝胶中电泳25 min，于凝胶成像系统中成像。

1.6 芯片杂交

取每个LAMP反应产物10 μl与200 μl杂交缓冲液混合10 min（温度设置为98℃），立即转移至0℃环境5 min，最后转移至芯片反应区内，平铺均匀，设置温度为45℃，杂交3 h后进行芯片扫描，根据荧光信号强度的分析结果。

1.7 敏感性检测

取一定量CP-DNA并测定其浓度，先将DNA浓度调整到22.5 ng/μl，后行10倍梯度稀释（范围为10-1～10-10），各取1 μl CP-DNA进行LAMP扩增，使用电泳法检测各浓度的扩增倍数。

1.8 特异性检测

先对本研究检测的CP-DNA和其他菌种DNA进行LAMP扩增，通过电泳法检测各反应产物的差异。后将各反应产物行基因芯片杂交，根据杂交信号的不同判断其特异性。

2 结果

2.1 LAMP检测CP特异性结果

仅CP-DNA经LAMP反应后出现大量的焦磷酸镁盐白色沉淀产物，经琼脂糖电泳后产生特有的阶梯状分布的扩增条带（图2），而金黄色葡萄球菌、志贺菌、普通变形杆菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、枯草杆菌、沙门菌DNALAMP扩增均无以上反应。

图2 CP的LAMP反应特异性结果

M.Marker（500 bp）；1.CP；2.金黄色葡萄球菌；3.志贺菌；4.普通变形杆菌；5.大肠埃希菌；6.霍乱弧菌；7.枯草杆菌；8.沙门菌；9.空白对照

2.2 LAMP检测CP敏感性结果

LAMP方法在DNA稀释倍数为107情况下仍可见电泳反应结果，可见LAMP扩增核酸为107倍（图3）。

图3 CP的LAMP反应敏感性结果

稀释后浓度1.22.5 ng/μl；2.22.5×10-1 ng/μl；3.22.5×10-2 ng/μl；4.22.5×10-3 ng/μl；5.22.5×10-4 ng/μl；6.22.5×10-5 ng/μl；7.22.5×10-6 ng/μl；8.22.5×10-7 ng/μl；9.22.5×10-8 ng/μl；10.22.5×10-9 ng/μl；M.Marker（500 bp）

2.3 CP杂交结果

只有CP组出现相应的电泳信号，而其他对照组无反应结果（图2），说明LAMP扩增CP-DNA的方法具有较高的特异性。将LAMP扩增产物与芯片杂交后，仅CP对应的位置出现杂交信号，而其他位置无杂交信号（图4），提示芯片杂交技术同样具有高度特异性。

图4 CP杂交结果扫描图

3 讨论

CP感染在世界各地的发病率有明显不同。我国流行病学调查显示，成人CAP患者中，CP感染明显高于肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）及嗜肺军团菌（Legionella pneumoniae，LP），感染率分别是28.1%、3.9%、5.2%[7]。有基础疾病的老年患者容易感染CP，且并发肺炎病情较重，常需住院治疗，甚至入住ICU。亚洲一项多中心研究表明，CP感染入住ICU的比例较MP及LP明显增高，入住率分别为16.7%、1.9%、6.6%[8]。CP感染所致的CAP早期临床症状和体征多不典型。传统的血清学抗体检查多适应于回顾性诊断，细菌培养所需时间较长，且培养条件苛刻，不能早期指导临床治疗。PCR检测技术发展迅速，目前已有多重PCR、巢式PCR、实时荧光PCR等，可以准确地检测CP，但其对引物及设备等要求较高[9]。LAMP技术是在等温条件下利用4种特异性引物识别靶基因的6个特定稳定区域后进行核酸扩增，只有靶基因6个特定区域与特异性引物正确识别才能启动LAMP反应，反应过程中产生大量的焦磷酸根离子，与镁离子结合形成白色的焦磷酸镁根沉淀[1]。根据沉淀法、电泳法及荧光法检测上述反应产物，因此LAMP技术不仅可以扩增靶基因，也能检测扩增产物；不仅能鉴别不同类型的病原菌，也能区分同一病原菌的各种亚型，具有高度特异性。相对于传统的PCR，LAMP技术具有恒温的优点，不会因改变反应温度而造成时间浪费，且设备要求简单，故具有更简便、经济、快速的特点。

LAMP技术虽然具有优势，但也有一定的缺陷，LAMP技术采用多条引物扩增，引物间互补扩增可出现假阳性，且常规LAMP技术只能检测一二个基因。基因芯片是生物芯片的一种类型，是以已知的特定寡核苷酸片段或基因片段作为探针，与未知序列核酸序列进行杂交的一种技术，具有快速、高效、高通量等特点。LAMP扩增技术与基因芯片杂交技术整合可以实现两者的优势互补，先通过LAMP反应扩增靶基因及对反应产物的初步检测，后应用基因芯片的荧光探针杂交技术对LAMP反应产物进一步检测，不仅可以达到更高的敏感性和特异性，还能同时实现对多个样本的检测。目前的联合技术有LAMP与微流控芯片整合的技术，LAMP与电化学基因芯片整合的技术等[10-11]。

总之，本研究应用LAMP联合基因芯片技术为快速准确地检测衣原体提供了一种新的方法，其稳定性、标准化等问题需要通过更多的研究去解决。

[参考文献]

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[11] Nakamura N，Ito K，Hashimoto M，et al.Development of mutisample detection system using a tag insertion primer and an electrochemical DNA chip[J].Anal Biochem，2011，419（2）：190-195.

（收稿日期：2014-08-11 本文编辑：李亚聪）

总之，本研究应用LAMP联合基因芯片技术为快速准确地检测衣原体提供了一种新的方法，其稳定性、标准化等问题需要通过更多的研究去解决。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-08-11 本文编辑：李亚聪）

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（收稿日期：2014-08-11 本文编辑：李亚聪）