长白猪CIDEC 基因、启动子的克隆及其在不同组织中的表达研究

李红强，郭振清，孙 健

(河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北秦皇岛 066600）

猪肉是日常生活中最常食用的肉类产品之一，随着经济水平和健康意识的不断提高，人们对猪肉品质的要求越来越高。研究发现，脂肪沉积与肉品质有关，脂肪含量影响瘦肉组织的百分比和肉品质[1-2]，因此对脂肪沉积尤其是肌内脂肪沉积的改良一直是遗传育种工作的重要目标。

猪背最长肌转录组数据发现，诱导细胞凋亡DFF45样效应因子C（Cell Death-Inducing DNA Fragmentation Factor alpha-like Effector C，CIDEC）基因在肌内脂肪中高表达[3]；羊蛋白质组数据分析发现CIDEC 在寒冷和饥饿状态下低表达，有利于脂滴分解，为机体提供能量[4]；肉鸡高甘油三酯组肌内脂肪高通量数据显示，CIDEC是参与调控代谢的重要基因[5]，也有研究发现CIDEC参与鸡脂肪肝的形成[6]。这些结果都表明CIDEC 是调控脂肪沉积的关键因子。

目前多数研究报道CIDEC 参与脂滴融合[7]、生长[8]和脂肪肝[9]、动脉粥样硬化[10]等疾病的形成。CIDEC主要在白色脂肪组织中表达，对于单室大脂滴的形成起着关键作用[11-14]。CIDEC过表达后细胞中多个单室小脂滴聚合形成单室大脂滴[15]；相反，敲除CIDEC后脂滴明显减小，线粒体和脂滴数量增加，葡萄糖的吸收和脂肪水解作用增强[16]。本团队前期研究发现，CIDEC定位于脂滴和内质网表面，能够促进脂滴的融合，且禁食条件下该基因的表达上调十分明显[17-18]。研究发现CIDEC启动子区域存在多个转录因子结合位点，包括PPARγ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ）[19]、PGC1α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1 Alpha）[20]、SREBP（Sterol Regulatory Element Binding Proteins）[21]等。

目前研究显示，CIDEC是猪肌内脂肪沉积的重要候选基因，但该基因的具体功能尚未报道。本研究采用RT-PCR、降落PCR 技术获得了长白猪CIDEC基因以及启动子序列且对其进行生物信息学分析，随后使用实时荧光定量PCR 技术分析了CIDEC基因在长白猪不同组织的分布情况，为深层次揭示长白猪CIDEC 的功能以及转录调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取体重约100 kg 的8 头6 月龄去势长白猪（河北昌黎县肉联厂提供）为供试材料，采集猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、皮下脂肪、腿肌、颈阔肌、肱二头肌、小肠和空肠12 种组织，立即置于液氮速冻，用于提取RNA 或DNA。

1.2 长白猪总RNA 提取、反转录与DNA 提取 用TRIzol（Ambion，美国）提取长白猪各组织总RNA，RNA完整性用琼脂糖凝胶电泳（1%）进行检测，浓度和纯度用NanoDrop2000（Thermo，美国）检测，检测合格后用反转录试剂盒（Abcam，中国）合成cDNA。快速DNA 提取检测试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）提取长白猪肝脏基因组DNA，置于-20℃备用。

1.3 长白猪CIDEC基因的克隆 根据GenBank 中猪CIDEC基因序列（登录号:NM_001112689.1），通过Primer Premier 5.0 软件设计引物（表1）。提取长白猪肝脏组织RNA 并反转录成cDNA，以此为模板利用不含酶切位点的引物进行PCR 扩增，PCR 扩增体系为25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL，模 板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1 μL，加入ddH2O 9.5 μL补足25 μL。PCR 扩增程序：96℃ 5 min；96℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，35 个循环；72℃ 10 min，4℃保存。将扩增产物与pMD18-T（宝生物工程有限公司，中国）相连接，以带酶切位点的引物再次扩增后将PCR 产物回收，利用限制性内切酶酶切并与pcDNA-3.1 载体相连、转化，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 通过qRT-PCR 检测CIDEC在各组织中的表达 利用Primer5.0 设计定量PCR 引物（表1），由北京辉远科技有限公司合成。PCR 反应体系20 μL：2×SYBR PCR mix（南京诺唯赞生物科技有限公司）10 μL，cDNA（100 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反应程序：预变性，95℃ 5 min；循环反应，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 个循环；融解曲线，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。以β-actin为内参校正个体间差异，以2-△△Ct方法进行统计分析，使用GraphPad Prism5 分析CIDEC在长白猪不同组织间的表达差异。

1.5 降落PCR 扩增CIDEC启动子 从Ensembl 数据库筛选猪CIDEC启动子序列，选取基因5'端上游约2 000 bp和第一个外显子下游200 bp 作为预测的转录调控序列并用Primer 5.0 设计引物（表1）。采用降落PCR 扩增长白猪CIDEC启动子，在冰上建立10 μL PCR 体系：10×Pfu DNA pol Buffer 1 μL，模 板（100 ng/μL）1 μL，Pfu DNA 聚合酶0.3 μL，上下游引物（10 pmol/L）各0.25 μL，dNTP（各2.5 mM/L）1 μL，ddH2O 6.2 μL。降落PCR 程序设置为95℃ 5 min；95℃ 45 s；65/50℃45 s，72℃ 3 min，95℃ 45 s，15 个循环；50/55℃ 45 s，72 ℃ 3 min，72 ℃ 5 min，30 个 循 环；4 ℃保 存。扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，用D2500 Gel Extraction Kit（Omega）对PCR 扩增产物进行纯化。纯化DNA 产物与pGL-3 Basic 载体连接，建立10 μL 连接体系：回收目的片段6 μL，300 ng/μL pGL-3 Basic 载体2 μL，T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，16℃连接过夜，将连接产物转化进入DH5α，挑取单克隆菌落并进行测序。

表1 长白猪CIDEC 基因CDS、启动子克隆和荧光定量PCR 引物

1.6 长白猪CIDEC生物信息学分析 利用NCBI 中BLAST 在线对比工具检索猪CIDEC基因的核苷酸序列，通过expasy 网站的protparam 工具、TMpred 工具以及TMHMM 工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TM HMM/）预测CIDEC 蛋白的理化性质和跨膜结构域，使用SPOMA 工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/）和Swiss model 预测蛋白质的二级和三级结构，NetPhos 3.1 和NetOGlyc4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/）预测该蛋白的磷酸化位点和甲基化位点。使用MEGA 6.0 软件进行生物进化树的构建。使用Methprimer 工具预测启动子区域CpG 岛（http://www.urogene.org/cgi-bin/meth primer/methprimer.cgi）。

2 结果

2.1 长白猪CIDEC基因的克隆 以长白猪皮下脂肪组织cDNA为模板，通过RT-PCR 技术扩增长白猪CIDEC基因的CDS 序列，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 条带（图1-A），该条带与Marker 相比在750 bp 附近位置，与预期设计条带大小一致。提取质粒并利用PCR技术以质粒为模板验证条带情况（图1-B），结果显示CIDEC条带在750 bp 左右，与预期条带大小相符，经生工生物工程（上海）股份有限公司测序获得核苷酸序列与NCBI 公布的序列一致。

2.2 长白猪CIDEC 生物信息学分析

2.2.1 长白猪与其他物种系统进化树分析 通过NCBI 数据库下载牛（Bos taurus，登录号：NP_001069499.1）、绵羊（Ovis aries，登录号：NP_001293044.1）、猪（Sus scrofa，登录号：NP_001106159.2）、人（Homo sapiens，登录号：NP_001308071.1）、骆驼（Camelus dromedarius，登录号：XP_010983254.1）、马（Equus caballus，登录号：XP_023475767.1）、小鼠（Mus musculus，登录号：NP_001359193.1）、大鼠（Rattus norvegicus，登录号：NP_001019504.2）、梭鲈（Sander lucioperca，登录号：XP_031134281.1）几个物种的氨基酸序列，构建系统进化树，图2 显示，猪与羊、牛的亲缘关系最近，其次为灵长类。

2.2.2 长白猪CIDEC 蛋白理化性质预测 CIDEC 蛋白共有248 个氨基酸，分子质量为27.899 ku，理论等电点（PI）为8.95，带负电荷的氨基酸残基数（天冬氨酸和谷氨酸）为25，带正电荷的氨基酸残基数（精氨酸和赖氨酸）为31，其分子式为C1242H1997N333O364S15，原子总数为3 951。长白猪CIDEC 蛋白的氨基酸残基中，频率最高的是亮氨酸（占13.71%），频率最低的是色氨酸（占0.81%），不含有吡咯赖氨酸及硒半胱氨酸。

2.2.3 长白猪CIDEC 的跨膜区和疏水性预测 预测长白猪CIDEC 蛋白质跨膜区（图3-A），根据预测说明分值超过500 表示具有一个跨膜区，即图中圈注位置。该跨膜区位于200～214 位氨基酸（TMHs），其中第1～199位氨基酸位于细胞膜外，而第215～248 位氨基酸位于细胞膜内。进一步预测长白猪CIDEC 的疏水性（图3-B），在32～40 位氨基酸有一段疏水区，67～96 位氨基酸有一段较长区域的疏水区，197～216 位氨基酸有一段疏水区。

2.2.4 长白猪CIDEC 蛋白质的二级结构和三级结构预测 分析长白猪CIDEC 蛋白质的二级结构显示，α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占47.18%、12.9%、5.65%、34.27%，说明α-螺旋和无规则卷曲为二级结构的主要形式。α-螺旋比较突出的区域是5～18、33～42、66-91、104～110、165～178、191～207、215～225、242～248，无规则卷曲比较突出的区域是1～4、43～54、124～148、226～241。β-转角与延伸链分布比较分散，比较集中的区域不显著。长白猪CIDEC三级结构进行建模显示（图4-A），全面模型评估值（Global Medal Quality Estimation，GMQE）是0.28，118 个残基（48% 的序列）已经通过单一最高评分，模型建立符合要求。分析与猪CIDEC 相互作用的蛋白质，发现该蛋白可能与CIDEA、PLIN1、PPAR2A、ACADL 等蛋白质存在相互作用（图4-B）。

2.2.4 长白猪CIDEC 磷酸化位点和糖基化位点预测 分析长白猪CIDEC 激酶磷酸化修饰位点和糖基化位点，结果显示其氨基酸序列中有45 个磷酸化位点，磷酸化位点分别位于酪氨酸、苏氨酸及丝氨酸的残基之上。根据“得分高于0.5 分以上位点发生了磷酸化”的标准，其中有1 个酪氨酸磷酸化位点、12 个苏氨酸磷酸化位点及32 个丝氨酸磷酸化位点。对该蛋白糖基化位点分析发现有12 处，分别位于33、34、35、38、43、46、58、59、130、139、141、232 氨基酸残基。

2.3 长白猪CIDEC基因在不同组织中的表达分析 由图5 可知，CIDEC基因在各个组织均有表达，其中在皮下脂肪组织最高，极显著高于其他组织，其次在肱二头肌、肺、小肠中高表达，在心脏、肝脏、脾脏都有不同程度的表达，在腿肌、颈阔肌、空肠和肾中极显著低于其他组织。

2.4 长白猪CIDEC启动子的克隆与CpG 岛分析 采用降落PCR 技术扩增启动子区域，产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测（图6）。对照DL2000 检测重组质粒的片段长度，条带清晰完整，无非特异性条带，条带大小在2 000 bp，结果与预期结果大小一致。分析启动子序列CpG 岛分布情况（图7），结果显示该序列不存在典型的CpG 岛，说明长白猪的CIDEC启动子区不依赖于CpG 岛调控区域，提示该区域发生甲基化的几率很低，转录活性不受甲基化抑制。

3 讨 论

本研究克隆了CIDEC基因的CDS 序列，该序列为747 bp，编码248 个氨基酸。CIDEC基因在猪中有2个剪切体，即CIDECα、CIDECβ，前者比后者在N 端少编码10 个氨基酸[22]，该文所获得序列为CIDECβ，与报道相符。该基因在羊中编码238 个氨基酸[23]，在牛中编码222 个氨基酸[24]，在人中编码238 个氨基酸[25]，说明该基因在不同物种之间存在差异。通过同源性分析发现，猪与牛、羊的同源性较高，说明其在物种间进化具有较高的保守性。

本文采集了长白猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、皮下脂肪、腿肌、颈阔肌、肱二头肌、小肠、空肠12 个不同部位的组织样品，通过qRT-PCR 检测发现CIDEC在皮下脂肪组织中高表达，这与在小鼠中的研究结果一致[26]。另有研究发现CIDEC在棕色脂肪组织中也有表达[27]，且其表达受不同营养情况影响[28]。CIDEC基因在不同组织中的表达与其功能密不可分，CIDEC敲除小鼠脂肪沉积能力显著降低[26]，并且表现出代谢综合症和胰岛素抵抗[29]。本研究中CIDEC在脂肪组织中表达量最高，而脂肪组织作为能量储存和动员的主要场所参与脂质代谢和脂肪沉积，提示不同组织间表达差异与CIDEC 功能有关，但目前对猪CIDEC基因在各个组织的相关报道较少，具体的功能仍不清楚，需要进一步研究。

多种转录因子协同调控CIDEC的转录表达，目前 发 现C/EBP（CCAAT/Enhancer Binding Protein）、PPARγ、SREBP 直接作用于该基因的启动子区域[30-31]，而TNF-α可 以 通 过C/EBP 下 调CIDEC的 表 达。另外，CIDEC的2 个转录本在不同组织中表达，推测其表达调控机制也不同。研究发现，CIDECα在白色脂肪组织中高表达，而CIDECβ在肝脏和棕色脂肪中表达，CIDECβ表 达 受 到CREBH (Cyclic-AMP response element-binding protein H) 的 调 控[32]。猪CIDEC受 哪些转录因子的调控目前尚未报道，对该基因启动子的克隆为其表达调控机制的研究提供帮助。

4 结 论

本研究成功构建了长白猪CIDEC真核表达载体，并对该基因进行了生物信息学分析，结果显示CIDEC 在生物进化过程中具有高度保守性。通过该基因组织表达谱分析，发现CIDEC在各个组织均有表达，其中在皮下脂肪组织表达量最高，在腿肌、肾脏和空肠中表达量较低。本研究还成功克隆了长白猪CIDEC基因启动子区，通过在线软件Methprimer 预测发现不存在CpG 岛。