基于RAD-seq 技术分析北京油鸡的遗传进化

张会永，李国辉，殷建玫，薛 倩，朱云芬，苏一军，朱 静，沈海玉，窦新红，韩 威

（江苏省家禽科学研究所，江苏扬州 225125）

由于各地区地形地貌、气候条件和民族文化的不同，中国的地方鸡品种表现出不同的表型特征，形成了丰富多彩、种质特性各异的禽种资源。地方鸡种的遗传多样性可为家禽新品种的培育以及现有品种的改良等提供遗传基础和支撑[1]，从分子水平对地方鸡不同品种间群体遗传关系和品种内群体遗传变异进行DNA 分析，将对地方鸡种种质特性评估及研究起到极大的推动作用，对地方鸡鸡种资源的保种及育种工作具有重要的理论和实际意义。

简化基因组测序（RAD-seq）技术是在二代测序基础上发展起来的一项基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术，该技术流程简单，不受有无参考基因组的限制，可大大简化基因组的复杂性，通过一次测序就可以获得数以万计的多态性标记[2]。RAD-seq 技术在玉米[3]、棉花[4]、三刺鱼[5]、牛[6]、老虎[7]、家蚕[8]、马[9]等研究中发挥着重要作用。Zhai 等[10]研究表明RAD-seq 技术在鸡上可进行鸡品种多态性图谱构建和群体遗传学研究。

北京油鸡原产于北京城北侧安定门和德胜门外近郊一带，2000 年被列入国家级畜禽品种资源保护名录[11]。2001 年北京油鸡被农业部（现为农业农村部）列为国家级畜禽品种资源重点保护品种。北京油鸡形成于清朝，曾作为清朝御膳用鸡，故又名“中华宫廷黄鸡”[12]，在长期的选择和驯化过程中形成了与其他地方鸡品种截然不同的的外貌特征，肉味鲜美、蛋质优良，是我国家禽库极其宝贵的遗传资源。本研究利用RAD-seq 技术对北京油鸡与其他20 个鸡品种进行SNPs 检测，通过比较找出北京油鸡保种群在遗传进化中的差异基因，鉴定驯化过程中的受选择基因，为开展北京油鸡种质特性评价、保种及育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验选择北京油鸡（BY）及对照组18 个地方鸡品种和2 个引进品种（白耳黄鸡BE、藏鸡ZZ、茶花鸡CH、仙居鸡XJ、固始鸡GS、大骨鸡DG、边鸡BJ、东乡绿壳蛋鸡DX、惠阳胡须鸡HX、金湖乌凤鸡JH、狼山鸡LS、萧山鸡XS、瓦灰鸡WH、大围山微型鸡WX、文昌鸡WC、瓢鸡PJ、斗鸡DJ、鹿苑鸡LY、和隐性白羽肉鸡RW、安卡AK）作为研究对象。对上述每个品种按照家系选择个体间无亲缘关系的个体各30 个（10 公、20 母），翅静脉采血1.5 mL，ACD抗凝，-20℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 RAD-seq 简化基因组测序 采用常规酚-氯仿法提取上述血液样品基因组DNA，并做好标记，采用ddRAD方法构建pair-end 文库，长度范围在300～500 bp，并进行简化基因组测序。

1.2.2 SNP 质控 对上述测序结果利用GATK 和samtools程序进行SNP 的鉴定。质控条件：Q20＞95%，ddRAD depth＞60%，SNP Callrate＞70%（在所有鸡种群体中的检出率），Callrate＞90%（在单个鸡种中的检出率），MAF＞0.05。

1.2.3 统计分析 应用Haploview 软件进行连锁不平衡（LD）分析，采用Pop Gen 软件计算观察杂合度、近交系数（Fis）和群体遗传分化系数，应用MEGA 软件进行群体聚类分析。采用PLINK 软件进行选择信号检测，以100 kb为窗口、10 kb为step 进行滑动的θπ 比率和Fst 分布计算。

2 结果

2.1 基因组SNP 鉴定 通过数据质控，在北京油鸡群体中鉴定出SNP 标记295 849 个。由图1 可知，这些SNP 主要分布在1、2、3、4、5 和Z 染色体上。总体上讲，SNP 分布数量与染色体长度呈正相关。

2.2 群体遗传多样性分析 群体遗传多样性统计量结果（表1）表明，北京油鸡的观察杂合度为0.200 4，呈中度杂合度；核苷酸多样度为0.205 9，呈中度多态；近交系数为0.026 5，近交水平在21 个鸡种中最低，结果表明北京油鸡在保种过程中得到了较好的保护。

表1 观察杂合度、核苷酸多样度和近交系数

2.3 连锁不平衡分析 基于SNP 通过pair-wise 算法计算得到的LD 度（r2）来评估LD（连锁不平衡）的水平，结果如图2 所示，LD 随距离增长逐渐下滑至平缓，SNP 距离为0～50 kb 范围内的LD 水平比在50～300 kb范围内的LD 水平高，但未超r2=0.33 的临界水平，在总体范围内，北京油鸡群体各等位基因不存在强烈的连锁不平衡现象。

2.4 群体遗传分化分析 计算北京油鸡群体全部检测到的SNP 位点和其他18 个地方鸡种、2 个引进品种的群体遗传分化系数，结果表明：北京油鸡群体遗传分化系数平均为0.154，较其他群体发生了显著分化。MEGA模型聚类分析结果（图3）也表明北京油鸡形成一个独立分支。

2.5 选择信号分析 根据北京油鸡群体核苷酸多样度比率和群体遗传分化系数对群体受到选择信号进行功能分析，结果表明受到强烈选择的前200 个基因主要集中在1、2、3、4、5 染色体上。受选择基因主要富集在脉管系统、分泌系统、细胞形态发生分化、心血管系统、蛋白质磷酸化等生物学通路（图4、5）。

3 讨 论

3.1 地方鸡种基因组SNP 鉴定 本实验利用RAD-seq技术测定了19 个地方鸡种和2 个国外引进品种的基因组序列，结果在北京油鸡群体中鉴定出SNP 标记259 412 个，打破了微卫星标记及线粒体DNA 序列变异遗传信息覆盖整个鸡基因组范围极其微小的缺点（微卫星标记仅有约30 个，线粒体DNA 的D-loop 区域全长也仅约1 200 bp）。本实验检测到的SNP 位点主要分布在1、2、3、4、5 和Z 染色体上，为遗传多样性最为丰富的区域，这为在基因组水平上分析北京油鸡遗传进化奠定基础。

3.2 遗传多样性和遗传结构分析 在19 个地方鸡种中，北京油鸡的观察杂合度、核苷酸多样度处于中下水平，仅高于鹿苑鸡、固始鸡、边鸡、东乡绿壳蛋鸡、河南斗鸡，这说明在特殊的生长背景下，北京油鸡在世代繁衍过程中保持了纯正的血统。本研究遗传结构分析验证了这一点，即北京油鸡在系统分化树上形成了一个独立的分支。北京油鸡的近交系数（0.026 5）在19 个地方鸡品种中处于最低水平，表明北京油鸡种群在保种过程中保种效果较好，保持了遗传多样性的相对稳定。

3.3 选择信号分析 我国养鸡业历史悠久，经过长期的自然与人工选择形成当前丰富的遗传资源。我国现有地方鸡品种114 个，每个地方鸡品种都有独有的遗传体系。选择即是对基因的选择，受到选择的特征、特性必然会在基因中留下痕迹。本研究分析了北京油鸡群体前200个受到强烈选择的基因，发现这些基因主要富集于脉管系统、分泌系统、细胞形态发生分化、心血管系统、蛋白质磷酸化等信号通路。

决定肉味的因素包括肌肉中肌内脂肪（IMF）、肌苷酶（IMP）的含量及其香味物质，与此相关的基因有ACAA2、PPARG、PLIN2、ATF4、TPK1。刘琛[13]研究发现ACAA2基因表达量与鸡肉IMF 含量呈极显著正相关。石恒波[14]研究认为，PPARG基因是调控脂肪酸代谢的核心转录因子，且不同亚型调控脂肪代谢的信号通路不同；PPARG基因影响脂滴形成，是脂肪细胞脂肪酸沉积的决定因子。钟婷婷等[15]在不同H-FABP基因型滇南小耳猪脂滴蛋白相关基因表达差异研究中发现，PLIN2为一种磷脂蛋白，可促进脂滴的形成，也能保护甘油三酯不被水解。陈超等[16]研究发现作为碱性亮氨酸拉链蛋白家族的ATF4基因在猪脂肪合成与沉积中发挥重要作用。硫胺素是重要的香味前体物质，当受热时可产生多种含硫和含氮挥发性香味物质。硫胺激酶基酶（TPK1）是体内合成代谢的关键酶之一，催化硫胺素的磷酸化，对最终硫胺素含量具有重要影响[17]。本研究对北京油鸡选择信号的分析也可作为北京油鸡肉质鲜美的佐证。

本研究对19 个地方鸡品种的受精率统计分析发现，北京油鸡的受精率高于其他地方鸡品种，说明北京油鸡的繁殖性状受到选择，与精子相关的基因有SPATA4、SYCP3、IFT27。毕瑜林[18]在北京油鸡种公鸡精液品质相关候选基因的SNPs 分析及转录研究中发现，SPATA4基因C3422A 位点与精子畸形率、精子密度、精液pH、体重及睾丸重显著相关，其中AA 基因型是种公鸡体重、睾丸重选择的优势基因型，可以用来辅助筛选高精液品质鸡群。SYCP3、IFT27在精子的生成过程中起重要作用[19]。这些基因的发现佐证了北京油鸡是一个具备高精液品质的品种，这个优异的繁殖性状有助于北京油鸡的开发利用。

此外，选择信号分析还表明，北京油鸡的感官知觉受到了选择（TRPM3）[20]，听觉受到了选择（ATP2B2）[21]。在免疫抗病方面也有不俗的表现，与此相关的受选择的基因有ATG7、EREG、RPS6，其中，ATG7能正调控巨自噬[22]和调控凋亡过程[23]；EREG可以正调控先天性免疫反应，通过激活ErK/MAPK 和Akt 信号系统刺激纤维母细胞、肝祖细胞等增殖，并在抗炎、创伤修复和肝脏再生中发挥重要作用[24]；RPS6参与免疫反应T细胞增殖及调控细胞凋亡[25]。

通过简化基因组测序技术找出北京油鸡在遗传进化过程中受到选择的基因，并对这些受到选择的基因进行功能注释分析，使得在分子水平上对地方鸡品种北京油鸡有了进一步的认识，对我国北京油鸡保种、评价及其开发利用有了科学依据。

4 结 论

本研究通过RNA-Seq 技术在分子水平上揭示了北京油鸡的遗传多样性及遗传结构，进一步对其种质特性进行挖掘，初步解析了北京油鸡优异的肉品质、精液品质等的形成机理，为北京油鸡的种质特性评价、保种工作及其开发利用提供了分子理论依据。