基质金属蛋白酶3对大鼠心肌纤维化细胞活力的影响

舒锦，汪海娅，金立

1.上海市静安区市北医院老年科，上海200443；2.上海交通大学医学院附属仁济医院老年科，上海200001

随着社会老龄化的发展，心血管疾病严重威胁老年人的健康和生命。心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是以心脏间质成纤维细胞过度增殖、胶原过度沉积及异常分布为特征的心脏间质重构，是各种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理表现，最终导致心脏功能衰竭而死亡[1]。目前对MF 的发病机制并不十分明确。血管紧张素II（AngII）是肾素-血管紧张素系统（RAS）的中心信号分子，对心肌细胞的成纤维化过程具有十分重要作用[2]。基质金属蛋白酶3（）是细胞外基质的调节剂，参与疾病的发生、组织修复和重塑。研究发现，在AngII 诱导的大鼠心脏成纤维细胞中显著上调，并且其在蛋白质-蛋白质相互作用网络中具有较高的节度点，是心脏重构的关键基因[3]。本研究通过构建过表达和敲低的细胞，探讨对心肌纤维化细胞活力的影响，为预防和逆转心肌纤维化探索新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大鼠心肌细胞H9C2 购自于中国科学院细胞库。AngII 和左卡尼汀采购自上海源叶生物科技有限公司。空载体、过表达质粒、si-RNA-negative control (siRNA-NC)、siRNA-（1/2/3）由研载生物技术（上海）有限公司提供。Lipofectamin 300 采购自Thermo Fisher Scientific 公司。RNA 逆转录试剂盒（PrimeScript RT Master Mix）和RNAiso Plus购自于TaKaRa 公司。CCK8 检测试剂盒购自于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 大鼠心肌细胞H9C2 用新鲜配制的含10%胎牛血清和1%双抗的DEME 培养基培养，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，次日换培养液，观察细胞的贴壁情况。当细胞贴壁生长至80%～90%时，进行细胞传代。

1.2.2 细胞转染 培养好的H9C2 细胞用无双抗的完全培养液重悬细胞，按每孔5×105个细胞，将细胞接种至6 孔板中，细胞培养箱中静置培养过夜。次日，更换细胞培养液为无血清培养液，每孔1 500L。根据制造商的说明，利用Lipofectamin 3000 制备不同的细胞转染液。即：a，4LLipofectamin 3000+250L 无血清Opti-MEM 培养基，室温静置5 min；b，3g 空载体/过表达质粒或100 nM siRNA-NC/siRNA-(1/2/3) +250L 无血清Opti-MEM 培养基，室温静置5 min；将上述a、b 混合，室温静置20 min，制备成不同的细胞转染液空白对照组只添加Lipofectamin 3000 和无血清培养基。将上述制备完成的不同细胞转染液转接于6 孔板中，6 h 后，更换培养液，加入完全培养基，于细胞培养箱中培养。48 h 后，收集细胞，用RNA 提取试剂盒提取不同组别细胞的总RNA，荧光定量PCR 检测的表达水平，用于评估细胞的转染效率。

1.2.3 AngII 处理 细胞最佳条件的筛选按每孔5×105个细胞，将H9C2 细胞接种至12 孔板中，放置于细胞培养箱中静置培养过夜。分别用0、10-8、10-7、10-6M 的AngII 分别处理H9C2 细胞6 h，12 h 和24 h。处理后，收集不同时间点的细胞，提取其细胞总RNA，用于后续的分析。

1.2.4 荧光定量PCR （RT-qPCR）参照Liu 等[4]的方法进行RT-qPCR 分析。根据RNA 逆转录试剂盒的说明书，对提取的RNA 进行反转录，合成cDNA。然后进行RT-qPCR 扩增，其引物序列如表1所示。RTqPCR 的反应条件为50℃3 min，95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40 个循环。其中，GAPDH 作为内参，和Axl 的mRNA 表达水平采用2-△△Ct 方法计算[5]。

表1 引物序列

1.2.5 CCK-8 检测细胞活力 心肌细胞的活力用CCK-8检测试剂盒进行检测。按每孔5×105个细胞，将H9C2细胞接种至6 孔板中，细胞培养箱中过夜。将细胞分成H9C2 组、心肌细胞纤维化组（MF 组）、MF+si-NC组、MF+si-组和MF+组。其中，MF 组、MF+si-NC 组、MF+si-组和MF+组的细胞均先用10-8M 浓度的AngII 处理24 h 后，分别用不同的细胞转染液转染H9C2 细胞。H9C2 组用等剂量的PBS 以相同方式进行处理。细胞转染24 h 后，对5 组细胞进行细胞计数。将上述5 组细胞按每孔1×104个细胞接种于96 孔板中，混匀后，细胞培养箱中过夜。第2 天用100M 左卡尼汀处理MF 组和MF+组的细胞，其余组的细胞用等剂量的PBS 处理。培养24、48、72 和96 h 时后，每孔加入10L CCK-8 溶液。培养箱内孵育2.5 h 后（OD 值≤2.0），用酶标仪在波长450 nm 处检测其吸光度值。

1.3 统计学分析 作图和统计分析软件均为Graphpad prism 5。计量资料均以均数±标准差（±s）表示。组间比较进行单因素方差（one-way ANOVA）分析。以＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染的效率 采用RT-qPCR 检测细胞转染后的mRNA 表达水平。见图1。与siRNA-NC 组相比，的表达水平在siRNA-(1) 组和siRNA-(2) 组中均降低（＜0.01），但其在siRNA-(1) 中，其下降幅度更大（图1A）。因此在后续的实验中，采用siRNA-(1) 进行转染H9C2 细胞，构建敲低的细胞。图1B 表明，与空载质粒组相比，的mRNA 表达水平在过表达组中增加（＜0.01），其值约是空载质粒组的80 000 倍。说明过表达细胞成功构建，可用于进一步实验。

2.2 AngII 最佳浓度的选择 图2显示，用不同浓度的AngII 处理细胞6 h 后，Axl 的表达水平与未用AngII处理的相比差异无统计学意义（＞0.05）；而处理12 h后，Axl 的表达水平仅在浓度为10-8M 组中下降（＜0.05）。当处理24 h 后，与未处理的相比，Axl 的表达水平在用不同浓度AngII 处理的组别中均下调（＜0.01），并且浓度为10-8M 的效果更显著。因此，本研究最终选用浓度为10-8M 的AngII 处理细胞24 h，诱导心肌细胞H9C2 纤维化。

图1 在干扰和过表达中的mRNA 表达水平：与空白对照相比，**＜0.01；与siRNA-NC 组相比，#＜0.01

图2 不同浓度的AngII 处理H9C2 细胞6 h、12 h 和24 h 后，Axl 基因的mRNA 表达水平。与未用AngII 处理的相比，*＜0.05、**＜0.01

图3 不同方式处理H9C2 细胞24 h（A）、48 h（B）、72 h（C）和96 h（D）后的细胞活力。与H9C2 组相比，＜0.05；与MF 组相比，＜0.05；与MF+100 M 左卡尼汀组相比，＜0.05

3 讨论

MF在心脏和血管重塑的发病机制中起重要作用，与高血压、心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病等临床许多疾病和病理过程有着密切的联系[6-8]。MF 可致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等严重并发症，预防和逆转心肌纤维化有助于为治疗老年心血管疾病提供新的分子靶点。

AngII 是一种血管活性肽，对心肌细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞有直接促进生长的作用，从而导致心血管重构，所以常作为一种促纤维化因子被用于诱导心肌细胞的成纤维化[9]。Axl 属于受体酪氨酸激酶，其在脉管系统、心肌、血管内皮等正常组织以及多种肿瘤组织中均有表达，与心血管系统疾病的发生有着密切的关系，Axl 的表达水平与心肌纤维化过程密切相关[10]。因此，本研究采用不同浓度的AngII处理大鼠心肌细胞不同时间，通过测量Axl 的表达情况来选择最佳的处理浓度与时间。结果表明，10-8M的AngII 处理H9C2 心肌细胞24 h，可以诱导细胞纤维化。

当心肌成纤维化细胞被激活增殖时，细胞外基质的合成分泌会增强，从而进一步促进细胞纤维化[11]。因此，通过抑制心肌成纤维化细胞的活性和增殖，可以抑制心肌成纤维化的过度积累，延缓心肌重构的发展。左卡尼汀是一种心肌能量代谢药物，可对心肌代谢予以调节，并有研究证实左卡尼汀可以有效的治疗心肌炎[12]。不仅能够降解胶原，而且还能降解基底膜成分，是其他几种（-1，-7，-8，-9）的激活剂[13]。本研究通过检测心肌成纤维化细胞的细胞活性，来探究对心肌成纤维化过程的影响。结果表明，当成纤维化细胞中敲低时，细胞活性受到抑制，与用100M 左卡尼汀处理后的细胞活性相似；而当成纤维化细胞中过表达时，其细胞活性增强；说明敲低可以抑制心肌成纤维化细胞的活性，抑制其纤维化过程。有证据显示，在动脉粥样硬化中，表达的增加更容易增加斑块破裂的可能性，从而促进心肌梗死和中风的发生[14]。Münch 等[15]分析了54 例肥厚型心肌患者的纤维化生物标记物，研究结果显示，的表达水平与心脏疾病（晕厥，心室性心博过速等）呈正相关关系。此外，另外一项研究表明，与假手术组相比，在结扎小鼠冠状动脉左前降支（一种心衰模型）的动物模型中，的表达水平上调，心肌纤维化增加；表明的上调与心肌纤维化的增加密切相关[16]。结合本研究结果，可以推测过表达会促进心肌纤维化过程，而敲低可能会通过降低心肌纤维化细胞的活力，来抑制成纤维化细胞的增殖，从而延缓老年患者心力衰竭等心血管疾病的发生。