广西人群自噬相关基因ATG5的单核苷酸多态性与ANCA相关性血管炎的关系

何佩耕，薛超，黎伟，黄莉，彭茜，饶金兰，李慧佳

原发性中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）是一组与ANCA高度关联的自身免疫性疾病。可累及全身中小血管，血管壁呈纤维素性炎症坏死，且血管壁无或仅有少量免疫复合物沉积［1］。其分类包括显微镜下多血管炎、韦格纳肉芽肿和嗜酸性肉芽肿多血管炎［2］。AAV的发病机制目前尚未阐明，现有研究表明其与环境、遗传、感染、机体免疫状态等因素相关［3］。自噬（autophagy）是普遍存在于真核生物细胞内高度保守的生命活动，其依赖于溶酶体对细胞内衰老受损的细胞器、错误折叠的蛋白质及其他大分子的降解-再利用的过程，对于细胞存活、维持内环境稳态具有重要意义［4］。已有研究报道自噬的异常参与了类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、炎症性肠病等自身免疫病及炎症性疾病的发生发展［5］。然而，自噬相关基因ATG5 的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在AAV中的遗传学意义仍缺乏相关研究。本研究选取ATG5基因上10个SNP位点，探讨其与广西人群AAV的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究纳入2005 年1 月—2019 年1 月于广西医科大学第二附属医院确诊为AAV 的住院及门诊患者177 例（AAV 组）。AAV 患者的诊断标准均参照2018 年增编的2012年Chapel Hill国际血管炎命名会议标准［2］，并且除外感染、药物、恶性肿瘤等因素引起的继发性血管炎和合并其他自身免疫性疾病的患者。对照组为同期在上述医院体检的健康志愿者216例。所有研究对象籍贯均为广西。本研究经广西医科大学第二附属医院医学伦理委员会批准（2018第KY-0100号），并获得所有研究对象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集 收集一般资料包括籍贯、年龄、性别。临床资料包括血红蛋白、白细胞计数、血清白蛋白、血肌酐、C反应蛋白（CRP）和红细胞沉降率（ESR）。AAV组确诊时的临床症状资料包括发热、水肿、血尿、咳嗽和咯血。

1.2.2 外周血收集和基因组DNA 提取 使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管分别收集所有研究对象2 mL外周静脉血，采用血液基因组DNA 提取系统DP319 试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，严格按照说明书步骤提取外周血基因组DNA。提取的DNA经Nanodrop2000［赛默飞世尔（中国）有限公司］检测吸光度值（A260/A280）为1.7～1.9，质量浓度＞25 mg/L，表示DNA 提取成功后，将DNA 分装保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3 ATG5 SNP 位点选取 SNP 位点选择遵循以下策略：（1）该位点位于 ATG5 基因功能区。（2）标签 SNP。使用haploview 软件从千人基因组计划1000GENOME（http://grch37.ensembl.org/）获取中国南方汉族人群（代码CHS）和中国北京汉族人群（代码CHB）ATG5 基因上存在的所有SNP后，从中筛选出标签SNP，作为本研究人群的标签SNP 的参考。（3）既往文献报道的与自身免疫病或炎症性疾病相关的SNP 位点。（4）SNP 位点的最小等位基因频率≥0.05。最终挑选出 10 个 SNP 位点，分别为 rs617994、rs1766193、rs656994、rs148316514、 rs573775、 rs662114、 rs510432、 rs506027、rs3761796、rs473543。

1.2.4 基因分型 基因分型采用多重聚合酶链反应（PCR）扩增结合高通量测序方法［6］，在生工生物工程（上海）有限公司完成。具体步骤为：设计并合成好一个包含10个已挑选好的ATG5 基因SNP 位点的引物池，然后通过两步PCR 的方法完成目标SNP位点序列的扩增和兼容Illumina测序文库的制备。第一轮PCR体系如下：DNA模板（10 mg/L）2 μL；上游引物池（10 μmol/L）1 μL；下游引物池（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL；RNase-free H2O 6 μL（总反应体积25 μL）。配制好反应体系后，在PCR仪（BIO-RAD，T100TM）上执行以下反应程序：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8个循环；98 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 个循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后，4 ℃保存反应产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确定产物大小正确，使用AMPure XP 磁珠纯化回收PCR 产物。以第一轮PCR产物为模板执行第二轮PCR反应，以获得测序文库。反应体系如下：第一轮PCR产物（10 mg/L）2 μL，通用 P7 引物（10 μmol/L）1 μL；通用 P5 引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL；RNase-free H2O 11 μL（总反应体积30 μL）。配制好反应体系后，执行如下PCR程序：98 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共5 个循环；最后72 ℃延伸5 min，反应完成后4 ℃保存反应产物。最终PCR 产物使用AMPure XP 磁珠纯化回收。各个PCR 产物等量混合后，使用HiSeq XTen 测序仪（Illumina，San Diego，CA）进行测序。扩增各SNP的引物序列见表1。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两样本均数的比较采用t检验，多个样本均数的比较采用方差分析，偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，采用K-W 秩和检验，多重比较后的组间两两比较采用Bonferroni 校正法；计数资料以例（%）表示，组间比较采用Pearsonχ2检验或Fisher 确切概率法。等位基因频率和基因型频率的计算、Hardy-Weinberg 平衡（HWE）检验抽样对象的群体代表性、SNP位点间连锁不平衡分析、单倍体频率及其与疾病风险关系的分析，均通过SHEsis 在线软件（http://analysis.bio-x.cn）完成。以P＜0.05为差异有统计学意义。

Tab.1 Primer sequences of SNP in multiple PCR表1 多重PCR扩增SNP位点引物池的引物序列

2 结果

2.1 研究人群人口学特征及比较 AAV 组177 例中男 68 例，女 109 例，年龄 19～73 岁，平均（53.90±15.01）岁；对照组 216 例中男 84 例，女 132 例，年龄18～81 岁，平均（51.35±12.65）岁，2 组平均年龄（t=1.795）及性别构成（χ2=0.009）差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 2组人群各SNP位点基因型及等位基因频率的比较 除rs506027在对照组中有1例样本分型不成功外，10个ATG5基因SNP位点在全部393个样本中分型成功，rs617994 在AAV 组和对照组中出现3 个等位基因 A、G、T，A 碱基的频率小于0.05（AAV 组0.020，对照组0.012），可能是由于突变所致，考虑到SNP 位点绝大多数为双等位位点，故在分析该位点时将携带A 碱基的例数剔除，在此仅分析G、T 等位基因。2 组样本所有位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，因此可认为研究人群具有群体代表性。AAV 组与对照组10 个ATG5 基因SNP位点的等位基因频率和基因型频率比较显示差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 SNP位点间连锁不平衡及单体型分析 10个ATG5基因SNP位点在研究对象中构建了6个常见单体型（频率＞0.03），见表3。取连锁不平衡系数D'≥0.8认为两SNP存在强连锁不平衡，倾向整体遗传。除rs473775与rs1766193未呈现出连锁不平衡外（D'=0.06），其余SNP间均呈现出连锁不平衡，所有10个SNP位点均处于同一个单体型区块（haplotype block）中（D'为0.84～1.00），见图1。各单体型之间AAV发病风险的差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

2.4 AAV 患者各SNP 位点基因型临床资料的比较 rs1766193、rs148316514的3种基因型患者中水肿的发生率差异有统计学意义，rs1766193 的3 种基因型中发热的发生率差异有统计学意义（P＜0.05），但经两两比较发现各基因型间差异无统计学意义（经Bonferroni 法校正P＞0.016 7），其余SNP 位点基因型的各临床症状的发生率差异无统计学意义，见表5。AAV 患者中rs617994 的3 种基因型患者的血清白蛋白水平，rs656994 的3 种基因型患者的血肌酐水平，rs510432、rs506027、rs473543 的 3 种基因型患者的血清白蛋白及ESR 水平差异有统计学意义（P＜0.05），其余SNP位点基因型的各实验室检查项目差异无统计学意义，见表6。

3 讨论

3.1 AAV 与自噬基因ATG5 AAV 病例相对罕见，临床漏诊及误诊时有发生，其自然病程预后差，常由于快速进展的肺、肾功能损害导致严重后果甚至死亡。近年来，诊断水平的提高和免疫抑制治疗的应用使AAV逐渐成为一种慢性复发性疾病，因此复发及长期免疫抑制治疗的不良反应成为影响AAV 患者预后的主要因素。加强对本病发病机制的认识有助于预防及改进治疗方法。目前认为遗传因素是AAV主要发病机制之一。

Tab.2 Comparison of genotypic and allelic frequencies of SNP loci between control and AAV groups表2 2组人群中各SNP位点基因型频率及等位基因频率分布比较

续表2

Tab.3 Common haplotypes composed of 10 SNPs表3 10个SNP构成的常见单体型

自噬几乎参与了病原微生物的清除、抗原提呈、抗体产生、免疫细胞发育分化、炎症介质的产生等免疫系统活动的各个过程。自噬过程涉及一系列自噬基因的调控，ATG5 基因是自噬的主要调控基因，其位于染色体6q21，长度约230 kb，包含10个外显子，其蛋白质通过与ATG12、ATG16L1 形成二聚体调控自噬体的生成［4］。大量研究表明自噬的紊乱与多种人类自身免疫性疾病和炎症性疾病相关。研究显示，外周血中各类单个核细胞，如 T 细胞［7］、浆细胞［8］、树突状细胞和B细胞［9］中自噬的改变密切参与了自身免疫性疾病系统性红斑狼疮的发生发展。You 等［10］报道 ATG5 基因 rs473542 和 rs510432 与再生障碍性贫血存在关联。Pham 等［11-12］的研究也提示ATG5 基因rs506027 与成人哮喘气道炎症、败血症等有关。近年来，Sha等［13-14］的研究提示自噬参与了AAV发病过程的重要环节，即中性粒细胞胞外诱捕网形成的过程。因此笔者推测自噬基因ATG5上SNP位点的多态性可能与AAV具有关联性。

3.2 与AAV 患者临床表现相关的SNP 位点 在本研究中，经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验发现10个SNP 位点在广西人群中具有多态性，但2 组间10 个SNP中的等位基因频率和基因型频率差异均无统计学意义，因此未采用非条件Logistic回归进行基因型与发病风险关系的分析。而此10 个SNP 在所纳入研究样本中构成6个常见的单体型，在2组间的分布差异也无统计学意义，提示本研究纳入的10个SNP位点可能与广西AAV人群的遗传易感性无关。

Tab.4 Effects of haplotype on AAV表4 单体型对AAV的影响 频数（%）

Tab.5 Comparison of clinical symptoms between genotypes of 10 SNP loci in patients with AAV表5 AAV患者10个SNP位点各基因型临床症状比较 例（%）

对AAV患者的临床资料分析显示，rs148316514各基因型中水肿、rs1766193各基因型中发热及水肿的发生率存在差异，但经多重比较发现各基因型组间两两比较差异无统计学意义，考虑是经Bonferroni法校正过于保守，且在患者中rs148316514 的TT 基因型仅为 2 例，rs1766193 的 GG 基因型仅为 5 例，两个亚组例数较少，还需要进一步扩大样本库后再行统计学分析，避免假阳性的发生。

实验室检查结果显示，rs617994 位点3 个基因型的血清白蛋白水平，rs510432、rs506027、rs473543位点各自3 个基因型的血清白蛋白、ESR 以及rs656994 位点3 个基因型的血肌酐水平差异有统计学意义。rs510432、rs506027、rs473543这3个位点均位于ATG5 基因的5'区启动子，呈现出完全连锁不平衡状态，只构成2 种单体型T-G-A 与C-A-G（rs510432-rs506027-rs473543）。Martin 等［15］发现，rs510432与ATG5基因启动子的活性显著相关，其可能与儿童哮喘有关。而自噬在自身免疫性疾病时可介导机体的炎症活动［16］，如在炎症肠病中，自噬参与调控了炎症小体的激活，自噬的缺乏会导致巨噬细胞释放大量炎性因子［17］。由此笔者推测，在AAV患者中不同的基因型和单体型影响了ATG5基因后续的转录以及翻译，并影响了自噬过程，从而改变了炎症细胞聚集及炎性因子的释放，进而导致了ESR 的差异。体内炎症活动的程度可能与肾脏的损害相关，导致血清白蛋白水平改变，这有待应用荧光定量PCR 测定不同基因型及单体型患者ATG5 基因表达量及后续实验验证。而rs617994和rs656994位点位于ATG5 基因的内含子区域，且尚未见关于该两位点的文献报道，笔者推测可能是由于该两位点参与了ATG5基因表达的调控过程引起了相应指标的变化，但仍需后续实验探究。

Tab.6 Correlation analysis of between genotypes of 10 SNP loci and laboratory index in patients with AAV表6 AAV患者10个SNP位点各基因型与实验室指标关联性分析

3.3 本研究的意义及可能存在的缺点 本研究探讨了自噬相关基因ATG5与自身免疫性疾病AAV的关系，为AAV 的遗传学病因及防治提供了依据，但也存在以下不足：（1）样本含量相对较少。（2）样本来源于住院以及门诊患者，门诊检查不完善，导致临床资料有所缺失，影响后续统计分析。（3）由于样本主要来自于广西医科大学第二附属医院，抽样上可能存在选择偏倚。因此仍需要扩大样本量，完善临床资料，在多地区多人群中进行更加深入研究。

综上所述 ，ATG5 基因 rs617994、rs1766193、rs656994、rs148316514、rs510432、rs573775、rs662114、rs506027、rs3761796、rs473543位点基因多态性在广西人群普遍存在，rs1766193多态性可能与发热和水肿发生有关，rs148316514 多态性可能与水肿发生有关，rs617994多态性可能与血清白蛋白水平有关，rs510432、rs506027、rs473543多态性可能与血清白蛋白及ESR有关，rs656994多态性与血肌酐水平有关，但上述10个SNP的多态性可能与广西人群AAV的遗传易感性无关联。