MLPA技术在DMD基因外显子拷贝数变异家庭基因诊断及产前诊断中的应用

曾玉坤，刘 玲，罗晓辉，丁红珂，余丽华，张 彦

(广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州 511400)

杜氏肌营养不良症是一种由DMD基因缺失、重复或点突变导致的致死性X连锁隐性遗传神经肌肉疾病,DMD基因位于X染色体短臂Xp21处，是目前发现的人类最大的基因，发病率为1/3 500[1-3]。杜氏肌营养不良症一般以男性多发，女性大多为致病基因携带者，主要临床表现为进行性、对称性肌无力，Gower征阳性，腓肠肌假性肥大。大多数患者在3～5岁发病，病情进展迅速，6岁以后出现行走困难，约10岁时多数患者就需使用轮椅生活，20～30岁时患者可因呼吸衰竭而死亡[3-5]，该病至今尚无治愈方法。目前，针对有杜氏肌营养不良症家族史的家庭进行产前诊断是避免生育杜氏肌营养不良症患儿的重要方法。多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术是一种在单一反应管内同时检测多达几十个不同核苷酸序列拷贝数变异的检测方法[6]。本研究采用MLPA技术对存在杜氏肌营养不良症生育史的家庭进行基因诊断和产前诊断，进一步探讨了MLPA技术的应用价值，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2019年1月就诊于本院产前诊断门诊，临床表现为运动功能减退和进行性肌无力，血清肌酸激酶(CK)水平显著升高，基因检测结果明确为DMD基因缺失或重复突变的杜氏肌营养不良症患儿(先证者)为研究对象，纳入标准：明确诊断为杜氏肌营养不良症的患儿，且其母亲再次妊娠，并要求进行产前诊断。最终纳入14个家系包括先证者、先证者母亲及胎儿共42例作为研究组。同时选取血清CK及肌电图正常，临床诊断排除杜氏肌营养不良症的3例健康成年男性作为对照组(依据杜氏肌营养不良症为X连锁隐性遗传的特点，排除该病的健康成年男性可排除患者及携带者的可能性，适于作为检测时的内对照使用)。研究组一般资料见表1。

表1 研究组一般资料

1.2方法

1.2.1DNA提取 抽取所有先证者及其母亲外周静脉血各2 mL，以乙二胺四乙酸二钾抗凝。采用血液基因组DNA提取试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)提取外周血标本基因组DNA，操作方法严格按照说明书进行。所有先证者母亲再次妊娠时在妊娠中期抽取羊水或绒毛标本进行产前诊断，羊水和绒毛标本均采用Qiagen DNA MINI Kit 50试剂盒进行DNA提取，操作方法严格按照说明书进行。对照组采集外周静脉血2 mL，与研究组同批次、使用同种方法提取DNA，于-20 ℃中保存备用。上述提取的所有研究对象的全基因组DNA使用NanoDrop 2000分光光度计(美国Thermo公司)测得外周血DNA水平均大于100 ng/μL，羊水DNA和绒毛DNA水平均大于30 ng/μL，A260/A280为1.8～2.0。

1.2.2羊水和绒毛标本污染鉴别 提取的羊水DNA和绒毛DNA均采用荧光PCR毛细管电泳法检测母亲和胎儿第13、18、21号染色体上的13个微卫星多态标记位点，用以对羊水和绒毛标本进行污染鉴别，防止漏诊或因母源污染而引起的误诊。

1.2.3MLPA检测及结果分析 使用SALSA MLPA P034-B2和P035-B1 DMD试剂盒(荷兰MRC Holland公司)对研究对象进行拷贝数变异检测。操作流程及后续数据分析方法按照试剂盒说明书进行，主要操作步骤，(1)变性：依据提取的标本基因组DNA水平使用相应的试剂盒洗脱液将基因组DNA稀释至5 μL(DNA总量为100～200 ng)，95 ℃变性5 min。(2)杂交：将变性后的基因组DNA冷却至25 ℃，分别加入1.5 μL P034-B2和P035-B1探针，再加入1.5 μL MLPA Buffer，60 ℃杂交过夜(约16 h)。(3)连接：将温度降至54 ℃，加入32 μL连接混合物(3 μL Buffer A、3 μL Buffer B、25 μL H2O、1 μL Ligase-65)，54 ℃连接15 min，然后98 ℃ 5 min终止连接反应。(4)PCR扩增：温度降至25 ℃，加入10 μL PCR混合物(7.5 μL H2O、2 μL PCR Primer mix、0.5 μL SALSA Polymerase)；PCR扩增条件为：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个扩增循环；循环完成后于72 ℃再延伸20 min。(5)毛细管电泳分离及数据分析：PCR扩增产物通过ABI 3500毛细管电泳仪进行电泳分离，观察各扩增产物电泳后的峰形图，以对照组的检测结果作为内对照，对检测的原始结果使用Coffalyser Net软件(荷兰MRC-Holland公司)进行分析。

2 结 果

本研究利用MLPA技术对14例先证者、先证者母亲和胎儿进行了DMD基因所有外显子拷贝数变异检测，其中先证者拷贝数缺失突变13例，重复突变1例，10例先证者发生45～54号区域内外显子半合子缺失；家系1～8先证者拷贝数缺失或重复片段遗传自其母亲；胎儿拷贝数杂合缺失突变3例，杂合重复突变1例，其余10例胎儿未检测到外显子缺失或重复，未重复先证者基因型。见表2。

表2 14个家系DMD基因MLPA检测结果

3 讨 论

杜氏肌营养不良症病死率高、预后不良，且至今尚无有效治疗方法，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。为了避免杜氏肌营养不良症患儿的出生，针对有该病患儿生育史的家庭，在明确先证者致病基因及类型的前提下进行产前诊断是预防该病发生的有效手段[7]。

DMD基因位于染色体Xp21区，全长约2.4 Mb，有79个外显子，编码了3 685个氨基酸，组成相对分子质量约为427×103的细胞骨架蛋白-抗肌萎缩蛋白[8]。DMD基因突变类型多样，已报道的就有7 000余种[9]，其中主要以片段缺失最为常见，约占65%；其次为片段重复，约占10%；其他类型的致病突变包括点突变、微缺失等[10-11]。相关研究表明，虽然遗传所致的DMD突变约占2/3，但新发突变占比高达1/3[12]，所以无杜氏肌营养不良症生育史或家族史的家庭仍需要重视该病的可能发病风险。

本研究14个家系中先证者DMD基因拷贝数缺失突变13例，重复突变1例，且所检测的拷贝数缺失、重复突变基本覆盖该基因所有外显子，其中第45～54号区域内外显子发生缺失的频率相对较高，本研究的14例先证者中有10例的拷贝数缺失突变与此区域内的外显子有关，这与国内相关文献报道的热点缺失区域相符[3,5]。8个家系中先证者的DMD基因缺失或重复片段遗传自其母亲，另有6个家系先证者均明确存在DMD基因缺失突变，但其母亲并未携带相同的致病突变，这些患儿可能是由其母亲卵子形成时DMD基因发生新发突变或其母亲存在生殖细胞嵌合所致。按照《中国假肥大型肌营养不良症诊治指南》的建议，生育过杜氏肌营养不良症患儿的母亲再次妊娠时应进行产前基因诊断[1]。

MLPA技术通过探针和靶序列DNA进行杂交、连接、PCR扩增、毛细管电泳分离及数据收集，再到后续的结果分析、得出结论，整个操作仅需1次反应就可以检测几十个靶序列拷贝数的改变，因而相较于传统针对79个外显子区域进行逐个序列检测的分析方法有了极大简化，检测效率得到了明显提高。此外，由于特殊的检测原理，MLPA技术检测灵敏度与特异度也非常高，相关数据表明其检测准确度高达99%[13]。MLPA检测试剂盒的商业化生产也让其检测操作变得更加简便、稳定、重复性好。

MLPA技术虽然具备较多优点，但仍存在不能检测未知的点突变及平衡易位等局限性,如果探针结合序列内存在点突变或微缺失等情况会导致外显子缺失，检测出现假阳性结果[14],因而对于临床症状明显，MLPA检测阴性的受检者，后续仍需要进行DNA测序以排除包括点突变、微缺失、微重复等其他突变类型。此外，鉴于MLPA技术会由于DNA变性不完全、盐污染等因素而导致探针检测信号的降低，使检测结果所显示的拷贝数比值处于临界值区间内，此种情况也需要进行重复检测验证，以保证结果的准确性[15]。

综上所述，运用MLPA技术能快速、准确且相对简便地检测DMD基因所有外显子拷贝数变异，这为有杜氏肌营养不良症患儿生育史的家庭明确致病因素提供了有效手段，同时为这类具有再生育意愿的家庭避免再次生育杜氏肌营养不良症患儿提供了科学的指导依据。