无创产前基因检测诊断Pallister-Killian综合征1例分析*

冯 暄，张 钏，张庆华，郝胜菊，郑 雷，周秉博，王 兴

(甘肃省妇幼保健院医学遗传中心，甘肃兰州 730050)

Pallister-Killian综合征(PKS)属于染色体微缺失综合征的一种，可导致患儿身体不同程度残疾、生长发育迟缓或智力损伤等。PKS的临床表现包括特征性颅面畸形、先天性心脏缺损、膈疝、癫痫和皮肤色素异常等[1]。PKS较为罕见，诊断困难，产前筛查是预防PKS患儿出生的有效手段[2]。本研究通过无创产前基因检测(NIPT)诊断了1例PKS，现将结果报道如下。

1 临床资料

孕妇，27岁，孕2产1，孕18周，否认近亲婚配，无遗传病家族史。于外院行超声检查提示：胎儿先天性膈疝，股骨、肱骨低于M-2SD线，心脏移位至右侧胸腔，肺动脉主动脉比值增大，心包积液，三尖瓣反流(少量)。因血清学产前筛查18-三体综合征高风险于本院就诊，18-三体综合征风险值为1/266。产科医生咨询后，建议直接行羊水穿刺产前诊断，但孕妇因担心羊膜腔穿刺风险，自愿选择NIPT，在充分了解NIPT的优势与局限性后，签署知情同意书，并于孕22周时进行检测。

1.1NIPT 静脉采集10 mL外周血，4 ℃下1 600×g离心10 min，取上清液2 mL分装后再次于4 ℃下16 000×g离心10 min，获得的血浆继续进行游离DNA 提取，剩余标本于-80 ℃保存备用。标本DNA检测合格后用PCR-free法进行文库制备，采用NextSeq CN500高通量测序仪(贝瑞基因公司)完成36 bp的单端测序，检测试剂盒为贝瑞基因公司生产的胎儿染色体非整倍体检测试剂盒(可逆末端终止测序法)，测序深度为0.3×，并进行生物信息学分析。NIPT结果提示：13、18、21-三体无异常，但存在12号染色体短臂部分重复dup(12)(p13.33-p11.1),Z值为20.81，起始位置为chr12:200000-34499999,片段大小为34.3 Mb，代表12号染色体短臂部分三体，见图1，需行进一步的有创性诊断确诊。

注：方框所示为染色体短臂重复部位，拷贝数为3。

图1 NIPT 12号染色体拷贝数变异散点图

1.2胎儿羊水细胞染色体核型分析 经产科医生咨询，签署知情同意书后，于孕24周时行羊水穿刺。抽取羊水30 mL，取10 mL用于高通量测序,其余20 mL分2管，以2 000 r/min离心10 min后弃上清，取沉淀细胞，加适量羊水细胞培养基，接种于无菌培养瓶内，置于37 ℃、含5%二氧化碳的培养箱中静置培养8～9 d，常规收获制片。以G显带染色制备染色体标本，对每例标本均按照《人类细胞遗传学国际命名体制(2013)》标准，计数20个中期分裂相细胞，分析5个核型。胎儿羊水细胞染色体核型分析结果：47，XX,+i(12)(p10)[58]/46,XX[42]，说明该标本为12号染色体短臂等臂染色体的嵌合体，见图2。

1.3胎儿羊水高通量染色体拷贝数变异检测(CNV-seq) 提取羊水基因组DNA，进行文库构建：通过片段化-连接、PCR前纯化、PCR扩增、PCR后纯化等过程，采用 NextSeq CN500高通量测序仪(贝瑞基因公司)，进行CNV-seq，测序结果经贝瑞基因公司Enliven®变异注释系统标注。CNV-seq结果为：dup(12)(p13.33-p11.1)(mos)，提示该标本12号染色体 p13.33-p11.1处检测到拷贝数为3.5，片段大小为 34.70 Mb 的嵌合重复区域，起始位置为chr12:160001-34860000，见图3、4。经查阅数据库[包括Decipher数据库、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、PubMed数据库及UCSC Genome Browser数据库]，得出该标本的变异包含了PKS的全部区域，结合羊水细胞染色体核型分析与CNV-seq的结果，该标本确诊为PKS。

1.4孕妇及其配偶外周血染色体核型分析 为明确变异来源，对该孕妇及其配偶进行了外周血染色体核型分析，夫妻双方G显带核型结果均未见异常，见图5，说明胎儿染色体变异为新发。

注：胎儿染色体核型为47,XX,+i(12)(p10)；箭头所示1个额外染色体，为12号染色体短臂等臂染色体。

图2 胎儿羊水细胞染色体核型图

注：方框所示为染色体拷贝数异常。

图3 CNV-seq 12号染色体测序散点图

注：A为12号染色体拷贝数变异测序图，方框所示为染色体短臂重复部位，拷贝数为3.5；B为12号染色体，方框所示为12号染色体短臂重复部位示意图。

图4 CNV-seq 12号染色体拷贝数变异图

注：A为孕妇外周血染色体核型：46,XX；B为孕妇配偶外周血染色体核型：46,XY。

图5 孕妇及其配偶外周血染色体核型图

2 讨 论

PKS的细胞遗传学特点是特定组织中以嵌合体形式存在的12号染色体短臂等臂染色体，故也称为等臂12p综合征或12p四体综合征。PKS的嵌合效应是由于额外染色体上携带的基因最终导致颅面部、心血管、肾脏和其他系统异常。PKS可累及体内所有器官及系统，其典型临床表现如下：(1)特殊面容包括皮肤色素异常、粗狂面容、眼距宽、高腭弓、前额突出、短颈等；(2)神经系统异常包括脑结构异常、癫痫、肌张力减退；(3)心脏缺陷包括心房和室间隔缺损；(4)胸部受累包括肺发育不全、膈疝；(5)胃肠道表现包括肠旋转不良及肛门移位；(6)骨骼肌肉系统发育异常包括PKS特有的生长模式，即在宫内提示明显的生长过度现象，但在出生后立即表现为生长发育迟缓；(7)75%的PKS患儿还有一定程度的视力损伤[2-3]。PKS胎儿在妊娠中期超声检查中可显示出明显的异常，包括羊水过多、膈疝、中枢神经系统异常、胎儿水肿、颜面部异常、心室扩张、短肢畸形等。当超声检查提示羊水过多、膈疝、肢根骨短小，尤其伴有生长过度时，应首先考虑PKS[4]。本研究中该孕妇妊娠中期超声检查提示：胎儿先天性膈疝，股骨、肱骨低于M-2SD线，心脏移位至右侧胸腔，肺动脉主动脉比值增大，心包积液，三尖瓣反流(少量)。符合PKS超声检查的主要特征。

PKS具有特殊的细胞遗传学特点，即异常的染色体有组织特异性，通常在皮肤成纤维细胞中可以检测到异常。因此，由于嵌合体的组织特异性，PKS的诊断可能经常被遗漏，并且通常在快速分裂的细胞，如外周血淋巴细胞中不能检测到[5-6]。已报道的病例中均未在外周血淋巴细胞中诊断出异常染色体i(12)(p10)[7]。据不同组织中期染色体核型分析统计，包含有异常染色体i(12)(p10)的组织包括：淋巴细胞(检出率为0%～2%)、成纤维细胞(检出率为50%～100%)、羊水细胞和骨髓细胞(检出率均为100%)[8]。皮肤成纤维细胞中检测嵌合体的成功率高于外周血，因为其异常细胞的损耗率低于T淋巴细胞[9]。本病例羊水细胞中i(12)(p10)检出率为58%,说明CNV-seq技术可以精准地检测出比例高于5%的嵌合体，也证明了在PKS的诊断方面，羊水细胞的检出率较高。羊水CNV-seq结果显示，12号染色体短臂重复，其拷贝数为3.5。一般来说，单纯的染色体重复检测到的拷贝数应为3，但该标本是12号染色体短臂等臂四倍体的嵌合体，所以导致其拷贝数为3.5。目前，诊断PKS的方法主要为细胞遗传学及分子遗传学两类，本病例采用的细胞遗传学技术为染色体核型分析，其是染色体检查的“金标准”；但由于PKS特殊的细胞遗传学特点，在不同组织中的检出率有很大差别，所以染色体核型分析技术对PKS的检出率并不高。本病例采用的分子遗传学技术为CNV-seq，其不针对特定区域设计探针，而是进行全基因组测序，覆盖了23对染色体，精确度高，可检测到相对分子质量为100×103以上的染色体变异，并具有很好的重复性与拟合度，与芯片技术比较，具有成本低、通量高、覆盖范围广及稳定性更高等优点。

PKS属于染色体微缺失综合征的一种。染色体的微缺失或微重复都属于染色体的拷贝数变异,可引起微缺失或微重复综合征，导致患儿身体出现不同程度器官功能异常、生长发育迟缓或智力损伤等[10]。有研究显示，有1.65%的孕妇在产前诊断中可检出有临床意义的染色体微缺失或微重复[11]。要想有效预防出生缺陷，就需要进行大规模的产前筛查，并对高风险人群进行产前诊断。NIPT作为高通量测序在临床应用最成熟的领域，其检测胎儿染色体非整倍体异常已经成为临床产前筛查的重要部分。2015年国际产前诊断协会针对NIPT出台了最新临床应用指南，明确指出NIPT可对染色体微缺失或微重复进行检测[12]。近年来，随着测序技术的进一步发展，一些实验室引入了染色体微缺失或微重复的无创产前筛查，作为除了整个染色体非整倍体检测之外的另一种选择，称之为扩展性的无创产前筛查技术[13]。扩展病种的无创性产前检测，筛查的范围扩大到全染色体基因组7 Mb的片段变异和常见的微缺失或微重复[14]，但目前并没有充足的临床应用反馈数据。本研究中采用NIPT筛查出胎儿12号染色体短臂重复片段大小为34.3 Mb,并通过CNV-seq证实与胎儿有创产前诊断结果相符，证明了NIPT对检测染色体大片段的重复有较高的灵敏度和特异度。

综上所述，PKS是一种散发的罕见染色体疾病，具有复杂的临床表现及特殊的遗传学特征，临床上往往容易漏诊,所以准确有效的产前诊断是避免缺陷患儿出生，减轻患儿家庭和社会负担的最佳手段。临床上，在产前发现羊水过多、先天性膈疝、过度发育的胎儿时应该高度警惕，同时建议孕妇完善产前诊断。此外，随着NIPT技术的飞速发展，相信其在产前检测领域将会做出更大的贡献。