血清ctDNA、CA72-4及CEA水平与胃癌患者化疗疗效的关系研究*

刘 静,鄂纬建,常 璠,纪荣祖

(1.青海省西宁市第三人民医院检验科，青海西宁 810005；2.青海大学医学院附属医院检验科，青海西宁 810001)

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，发病率和病死率均占我国恶性肿瘤的第2位[1]。2015年相关数据显示，我国每年胃癌新发病例数为67.9万，死亡病例数为49.8万，分别占全球的42.6%和45.0%[2]。但我国胃癌早期诊治率低于10%，约90%的胃癌患者确诊时已处于进展期，错过了手术治疗的最佳时机，此时手术后5年生存率低于30%[3-4]。化疗通常作为进展期胃癌的主要治疗手段，但目前缺乏预测化疗预后的敏感生物标志物[5]。虽然有研究表明，糖链抗原72-4(CA72-4)和癌胚抗原(CEA)是诊断胃癌灵敏度较高的生物标志物，但关于其对胃癌化疗疗效评价方面的研究较少[5-8]。近年来，有文献报道将循环肿瘤细胞DNA(ctDNA)应用于肿瘤放化疗疗效评价，ctDNA被称为“液态活检”，具有创伤小、可重复等优点[9-10]。本研究探讨了血清ctDNA、CA72-4和CEA水平与胃癌患者化疗疗效的关系及其在化疗疗效判断中的应用价值，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年10月至2013年2月在西宁市第三人民医院接受根治性远端胃大部切除术，并进行术后化疗的早期胃癌患者30例作为研究对象。所有患者均经胃镜检查及病理活检确诊为早期胃癌，其中男19例，女11例；年龄35～78岁，平均(53±8)岁；TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期9例；肿瘤直径>5 cm者10例，≤5 cm者20例；分化型7例，未分化型23例。纳入标准：卡氏评分>60分；第1次接受化疗；能耐受全身静脉化疗且均能接受2个疗程以上治疗。排除标准：合并严重心、肝、肾等脏器疾病；既往接受过化疗；对化疗药物过敏；合并肿瘤转移；治疗依从性差。本研究经西宁市第三人民医院伦理委员会批准，获得患者及其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2化疗方案 所有患者术后第4周给予DCF改良方案化疗。第1天静脉滴注多西他赛(江苏恒瑞医药，批号:171109AF)75 mg/m2；第2天静脉滴注奥沙利铂(南京制药厂有限公司，批号:201711112)130 mg/m2；第1～14天口服替吉奥胶囊(山东新时代药业有限公司，批号:023170308)80 mg/(m2·d)，分早晚服用，然后停药7 d再进行第2个疗程。21 d为1个疗程，连续治疗2个疗程。

1.3血清ctDNA、CA72-4和CEA检测 分别于术后化疗前和化疗疗程结束时收集患者清晨空腹静脉血5 mL，3 500 r/min离心10 min，分离得到血清，-20 ℃保存待测。

1.3.1采用RT-PCR检测血清ctDNA水平 量取血清750 μL，加入750 μL磷酸盐缓冲液，混匀，95 ℃孵育10 min，16 000×g 离心10 min，取上清液，-80 ℃保存，备用。将PCR反应液(Super green 1.0 μL，PCR正向引物0.5 μL，PCR反向引物0.5 μL，Master 10.0 μL，H2O 6.0 μL，DNA模板2.0 μL)加入PCR扩增板内，盖上透明膜，轻轻混匀，设置标准品孔和待测品孔。扩增条件：95 ℃ 5 min 1次，95 ℃ 10 s 45次，60 ℃ 20 s 45次，72 ℃ 20 s 45次。扩增结束后，检测 Ct值，以标准品的Ct值做标准曲线，代入待测品Ct值计算得到ctDNA水平。

1.3.2血清CA72-4、CEA水平检测 CA72-4和CEA ELISA试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司，检测过程严格按照说明书进行。设置标准品孔、待测品孔和空白孔，除空白孔外，标准品孔加不同水平的标准品50 μL，待测品孔加待测标本50 μL；标准品孔和待测品孔中分别加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，封板膜封板后37 ℃孵育60 min；弃去液体，吸水纸吸干后用350 μL洗涤液洗涤5次，吸水纸吸干；每孔加底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加终止液50 μL，于450 nm波长下检测各孔吸光度值。以标准品吸光度值和水平做标准曲线，代入待测品吸光度值，即可计算出待测品中CA72-4、CEA水平。阳性结果判断标准：ctDNA>87.12 μg/L为阳性，≤87.12 μg/L为阴性；CA72-4>4.25 μg/L为阳性，≤4.25 μg/L为阴性；CEA>2.41 μg/L为阳性,≤2.41 μg/L为阴性。

1.4疗效评价标准

1.4.1肿瘤标志物疗效评价标准 依据肿瘤标志物疗效评价标准[11]，完全缓解(CR)：升高的肿瘤标志物水平恢复正常且维持4周以上；部分缓解(PR)：升高的肿瘤标志物水平下降≥65%，并维持4周以上；疾病稳定(SD)：升高的肿瘤标志物水平下降<65%或肿瘤标志物水平升高<40%；疾病进展(PD)：肿瘤标志物水平升高≥40%或从正常水平到超过正常水平，或升高的肿瘤标志物水平未降至正常值10倍以下。

1.4.2客观疗效评价标准 按照RECIST 1.1标准[12]评估患者疗效。CR：所有病灶均消失不见；PR：基线病灶最大径之和减少30%以上；SD：基线病灶最大径之和有减少但未达PR，或有增加但未达PD；PD：基线病灶最大径之和至少增加20%或出现新病灶。经化疗后客观疗效评价，本研究纳入的30例患者中，CR患者10例，PR患者9例，SD患者6例，PD患者5例。

1.4.3有效、无效判断 以上两种评价标准均根据疗效将CR、PR界定为有效，将PD、SD界定为无效。

1.4.4预后评价 化疗结束后对所有患者进行为期5年的随访，以5年生存人数和总生存率作为最终远期预后评价指标。

2 结 果

2.1不同客观疗效患者化疗前后ctDNA、CA72-4、CEA水平比较 化疗后CR和PR患者ctDNA、CA72-4和CEA水平与化疗前比较均明显降低(P<0.05)；SD和PD患者中，ctDNA水平化疗前后差异无统计学意义(P>0.05)，而CA72-4和CEA水平化疗后与化疗前比较均明显升高(P<0.05)，见表1。

表1 不同客观疗效患者化疗前后ctDNA、CA72-4、CEA水平比较

2.2肿瘤标志物疗效与客观疗效评价一致性结果 ctDNA、CA72-4、CEA联合检测的疗效评价符合率为93.33%，明显高于各指标单独检测的符合率(P<0.05)；且3项指标联合检测的Kappa值为0.71，吻合度较强，一致性较好；ctDNA、CA72-4、CEA单独检测的Kappa值分别为0.37、0.31、0.12，吻合度均较弱，见表2。

表2 肿瘤标志物疗效与客观疗效评价一致性结果

续表2 肿瘤标志物疗效与客观疗效评价一致性结果

注：与ctDNA+CA72-4+CEA比较，*P<0.05。

2.3ctDNA、CA72-4、CEA对胃癌化疗疗效的评估价值及与化疗预后的关系 ROC曲线分析结果显示，以客观疗效评价结果为标准，ctDNA、CA72-4、CEA联合检测评估胃癌化疗疗效的灵敏度为94.74%，特异度为90.91%，曲线下面积(AUC)为0.915，均高于3项指标单独检测，见表3。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，ctDNA、CA72-4和CEA阴性患者总生存率均明显高于阳性患者(χ2=5.625，P=0.018；χ2=4.073，P=0.044；χ2=4.344，P=0.037)，见图1。

注：A为CEA的Kaplan-Meier生存曲线；B为CA72-4的Kaplan-Meier生存曲线；C为ctDNA的Kaplan-Meier生存曲线。

图1 Kaplan-Meier生存曲线

表3 ctDNA、CA72-4、CEA单独及联合检测对胃癌化疗疗效的评估价值

注：—为无数据。

2.4胃癌患者化疗预后的影响因素分析 单因素分析结果显示，肿瘤直径、分化程度、ctDNA、CA72-4和CEA对患者化疗预后有影响(P<0.05)，见表4。将对化疗预后有影响的因素纳入多因素Cox回归分析，结果显示，ctDNA、CA72-4和CEA是影响胃癌患者化疗预后的独立因素(P<0.05)，见表5。

表4 影响胃癌患者化疗预后的单因素分析

续表4 影响胃癌患者化疗预后的单因素分析

表5 影响胃癌患者化疗预后的多因素Cox回归分析

3 讨 论

肿瘤标志物是可以反映肿瘤生长转移的一类物质。研究显示，肿瘤标志物与肿瘤增殖和肿瘤细胞数量直接相关[7]，提示通过检测肿瘤标志物表达水平可以评估肿瘤治疗效果和预后。理想的肿瘤标志物应具有高特异度、高灵敏度、便于检测等特点，然而单一肿瘤标志物特异度、灵敏度低，现在多建议采用多个标志物联合及动态检测[13]。

CEA是一种肿瘤细胞表面抗原，所有内胚层来源肿瘤均可见CEA表达异常，其主要用于消化道肿瘤检测。CA72-4是一种高分子糖蛋白类癌胚抗原，是检测胃癌的首选肿瘤标志物。有研究发现，胃癌患者化疗后CEA、CA72-4水平较化疗前明显降低，同时还发现胃癌患者CEA水平与分化程度呈负相关[14-16]。本研究结果显示，胃癌化疗后客观疗效为CR和PR的患者CEA和CA72-4水平较化疗前明显降低且恢复至正常水平范围内，而客观疗效为SD和PD患者的血清CEA和CA72-4水平较化疗前明显升高，提示CEA、CA72-4可以作为胃癌疗效评价的重要参考指标。本研究进一步分析了CEA和CA72-4评价化疗疗效的价值，将其与客观疗效评价结果进行比较，发现CEA和CA72-4评价结果与客观疗效评价结果的符合率分别为56.67%和66.67%，Kappa值分别为0.12和0.31，提示CEA和CA72-4单独应用评价胃癌化疗疗效价值较低，分析其原因可能与以下因素相关：CEA或CA72-4可以与血液中其他抗原相互结合，导致部分胃癌患者接受化疗后会出现短暂、可恢复的CEA水平升高[17]，从而影响结果判断，导致与客观疗效的评价符合率较低，提示CEA和CA72-4水平的升高并不一定存在肿瘤进展或复发转移，可能是这部分患者对化疗的短暂反应。基于此，SORBYE等[18]也建议不应单独依据CEA或CA72-4水平来评价胃癌患者化疗疗效。

循环肿瘤细胞和ctDNA被认为是恶性肿瘤发生转移的重要标志物，对预后判断具有一定的指导意义[19]。有文献报道，ctDNA可以作为监测胃癌进展的生物标志物，是整体生存率及无进展生存率的预测因素之一[20]； 还有文献报道，ctDNA可以用于多种肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、胃癌等的预后和疗效评估[21-22]。本研究发现，胃癌化疗后客观疗效为CR和PR的患者ctDNA水平较化疗前明显降低且恢复至正常水平范围内，客观疗效为SD和PD的患者ctDNA水平较化疗前比较无明显变化，提示ctDNA水平可以作为胃癌化疗疗效评价的指标。进一步对ctDNA评价胃癌化疗疗效与客观疗效结果的一致性进行了分析，结果发现，二者疗效评价符合率为73.33%，吻合度较弱(Kappa值为0.37)，分析其原因：肿瘤细胞被机体自然杀伤细胞吞噬而导致血液中残留的ctDNA水平较低；但ctDNA检测结果易受到采血时间、饮食、个体差异等因素影响，导致检测水平波动较大，从而影响对化疗疗效的评价[23-24]。

本研究将ctDNA、CA72-4和CEA 3项指标进行联合检测，结果显示，ctDNA、CA72-4和CEA联合检测评价的胃癌化疗疗效结果与客观疗效结果的符合率为93.33%，吻合度较强(Kappa值为0.71)，提示3项指标联合检测在胃癌疗效评价中具有重要价值。

为了进一步评价ctDNA、CA72-4和CEA水平对胃癌化疗疗效的评估价值，本研究进行了ROC曲线分析，结果显示，ctDNA、CA72-4、CEA联合检测对胃癌化疗疗效评估的灵敏度、特异度和AUC均高于3项指标单独检测，提示3项指标联合检测可以有效评估胃癌化疗疗效，指导临床治疗。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，ctDNA、CA72-4和CEA阴性患者总生存率均明显高于阳性患者，提示上述3项指标可以作为评价胃癌远期预后的重要参考指标。多因素Cox回归分析结果显示，ctDNA、CA72-4和CEA是影响胃癌化疗患者预后的独立因素。此外，由于本研究纳入的病例为早期胃癌患者，并未发现年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期和分化程度对胃癌化疗疗效的独立影响。

4 结 论

综上所述，血清ctDNA、CA72-4和CEA联合检测对于早期胃癌化疗的远期疗效预测具有较高准确性，其疗效评价与客观疗效评价结果一致性较好。但是由于本研究纳入的病例数较少，结果的可靠性和科学性还需要后续积累样本量以进一步验证。