关岭牛PPAP2B基因mRNA在不同组织中的表达分析

周 萍， 陈 伟*， 范 瑞， 秦 媛， 陈 祥

(1. 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025；2. 贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳550025； 3. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)

关岭牛因中心产区在贵州省西南部关岭布依族苗族自治县而得名，属于役肉兼用型黄牛，是贵州高原山地特有的优良黄牛品种，具有典型的山地牛体态特征和较好的役用、肉用性能，善爬高山陡坡，对复杂的气候条件有良好的适应性[1]。PPAP2B基因编码磷脂酸水解酶3(LPP3)，广泛表达于真菌(如酵母)、细菌、人体的血浆和细胞内膜、小鼠的白色和棕色脂肪组织[2～4]。全基因组关联研究发现，PPAP2B基因是冠状动脉粥样硬化性疾病的致病基因之一，与冠心病、肿瘤等多种疾病相关[5，6]。本研究通过分析关岭牛PPAP2B基因mRNA在不同组织中的表达水平，为后期研究动物PPAP2B基因的功能提供基础参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 主要试剂Trizol试剂、SYBR Green supermix，购自美国Life technologies公司；DL 2 000 DNA Marker，购自宝生物工程有限公司；反转录试剂盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)、2×EsTaqMasterMix、Goldview、氯仿、无水乙醇等，均购自北京康为试剂科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成根据GenBank已公布的PPAP2B基因CDS区序列，运用prime 5.0软件设计PPAP2B荧光定量PCR引物，选取GAPDH作为内参基因。引物由宝骏生物技术有限公司(上海)合成。合成的引物用去离子水稀释100倍，置于-20 ℃ 冰箱保存。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.2RNA提取和cDNA合成采用Trizol法提取关岭牛各组织样品的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。根据反转录试剂盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)说明书操作步骤合成cDNA。反转录反应体系20 μL：dNTP mix 4 μL，Primier mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT(0.1 mol/L)2 μL，HiFiSaript(200 U/μL)1 μL，RNA 1 μL，双蒸水6 μL。反应条件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。反应结束后短暂离心，使用超微量紫外分光光度计测量cDNA浓度，并用去离子水稀释至500 ng/mL，-20 ℃保存备用。

1.2.3 目的基因实时荧光定量PCR检测运用实时荧光定量PCR法检测各样品中PPAP2BmRNA表达量。反应体系10 μL：SYBR Green supermix 5 μL，cDNA模板(500 ng/μL)1 μL，上、下游引物各0.5 μL，双蒸水3 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，61 ℃退火5 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。溶解曲线分析：95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，然后以每10 s上升0.5 ℃的速率从60 ℃升高到95 ℃。每个样品做3个重复。

1.2.4 数据统计分析运用Excel 2007对荧光定量PCR数据Cq值进行统计分析，采用2-△△CT法处理数据，以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 17.0统计分析软件进行处理，组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1RNA完整性检测由图1可见：各组织中提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，18S和28S条带清晰，无明显扩散现象。经超微量紫外分光光度计检测，RNA浓度适中，质量较好，可用于下一步实验。

2.2 实时荧光定量PCR产物的特异分析通过实时荧光定量PCR反应得到目的基因PPAP2B和内参基因GAPDH的溶解曲线及扩增曲线(见图2、图3)。二者的扩增曲线拐点清晰，斜率较高，均呈S型，表明扩增效率较高；溶解曲线均为光滑的单峰曲线，Tm温度附近无明显杂峰，表明引物特异性和重复性好，无引物二聚体出现，符合试验的质量控制要求。

2.3PPAP2B基因mRNA在不同组织的相对表达量由图4可见：关岭牛PPAP2B基因mRNA在脂肪组织中的相对表达量高达34.455 6，显著高于其他组织(P<0.05)；其次为小肠、心脏、肝脏、大腿肌；在背最长肌组织中最低，只有0.033 3。

3 结论

本试验结果表明，关岭牛PPAP2B基因mRNA在脂肪组织中表达量最高，在其他组织中表达量很少甚至几乎不表达，提示PPAP2B基因可能在牛的脂肪沉积过程中发挥作用。

4 讨论

有研究发现，PPAP2B基因通过调控β-catenin信号通路影响内皮细胞的迁移[7]；通过调节溶血磷脂的信号反应影响平滑肌细胞的表型可塑性[8]。在小鼠胚胎发育时期如果敲除PPAP2B基因会导致小鼠的血管内皮细胞和造血细胞发生异常，导致小鼠胚胎死亡；并且在小鼠的胚胎时期PPAP2B在乳腺原基、心脏瓣膜等多种诱导相互作用的结构中表达有显著的变化[9]。PPAP2B基因编码的磷脂酸磷酸水解酶3(LPP3) 是1种膜蛋白， 在各种磷脂酸的脱磷酸过程中起催化作用[10]。同时LPP3对于调节脂分化的脂质信号通路和膳食甘油三酯合成所需的细胞内代谢通路都是必不可少的[11]。根据牛的生长发育规律，牛的脂肪会在1周岁之后快速沉积[12]。本研究表明PPAP2B基因可能与牛的脂肪沉积有关，后期可进一步研究其在牛的脂肪沉积中所起的作用。