一例牛支原体与巴氏杆菌混合感染的诊治

蔺俐仲， 邓珊珊， 张 海， 徐春志*， 景书灏， 袁 林， 刘 霞， 杨 源

(1. 贵阳市草地站，贵州贵阳550081； 2. 贵州省清镇市农业农村局，贵州清镇551400；3. 贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550081； 4. 贵州省息烽县动物疫病预防控制中心，贵州息烽550300；5. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008)

2019年3月，贵州省清镇市某养牛场部分牛发病，临床症状表现精神沉郁、咳嗽、体温升高、呼吸困难、流浆液性鼻涕。病理剖检发现病变肺脏质地变硬，肺脏表面有白色坏死灶。为确诊病因，采集病牛肺脏组织进行细菌分离培养、病原核酸PCR检测。

1 材料与方法

1.1 病料采集牛场病例肺脏组织作为检测病料。

1.2 主要试剂牛支原体检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增所需试剂(购自天根生化科技有限公司)；药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限公司)。

1.3 细菌分离培养无菌操作将肺脏组织接种在鲜血琼脂培养基，分别进行厌氧和需氧条件下37 ℃恒温培养24 h，观察菌落生长情况，对分离细菌进行革兰氏染色镜检。

1.4 分离细菌PCR检测挑取菌落在鲜血琼脂培养基纯化培养过夜及5 mL液体培养基中震荡培养过夜。提取分离菌DNA，应用PCR方法对目的基因(巴氏杆菌KMT基因)进行扩增。扩增体系25 μL：2×TaqMixture 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物(KMT1：5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’；KMT2：5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’)各 2 μL，模板4 μL，灭菌双蒸水4.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(预扩增片段457 bp)。

1.5 牛支原体PCR检测参照牛支原体检测试剂盒说明书进行。采集病死牛肺脏组织，研磨后加无菌PBS 1 mL混匀，12 000 r/min离心后取上清提取样品DNA。扩增体系25 μL：PCR反应液12.5 μL，酶混合物4.5 μL，模板5 μL，灭菌双蒸水3 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(预扩增片段602 bp)。

1.6 分离细菌药敏试验选择多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、泰妙菌素、氟苯尼考、替米考星、泰乐菌素、新霉素按照药敏纸片法进行。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果厌氧培养鲜血琼脂培养基无菌落生长。需氧培养鲜血琼脂培养基生长有灰白色、露珠状小菌落；挑取菌落进行革兰氏染色，在显微镜(油镜)下观察到革兰氏阴性短小杆菌。

2.2 分离细菌PCR鉴定结果由图1可见，PCR扩增出457 bp特异性目的片段，确定为巴氏杆菌。

2.3 牛支原体PCR检测结果由图2可见，肺脏组织样品中检出602 bp牛支原体特异性核酸片段，提示有牛支原体感染。

2.4 巴氏杆菌药敏试验结果抑菌效果由高到低依次为：多西环素、氟苯尼考、替米考星、泰妙菌素、磺胺间甲氧嘧啶钠、新霉素、泰乐菌素。

3 结论

根据临床症状、病理变化、细菌分离培养、病原PCR检测结果，诊断为牛支原体与巴氏杆菌混合感染。

4 治疗

推荐该场使用对巴氏杆菌和支原体均有较好抑制效果的多西环素和氟苯尼考作为治疗首选药物(按说明书用量和方法)，同时补充能量和电解质。经治疗后病情得到了有效控制。

5 讨论

5.1牛支原体(Mycoplasmabovis)是柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属的成员，感染牛可引起肺炎、乳房炎，以及怀孕母牛流产、生殖器感染等多种疾病[1]。牛支原体无细胞壁，以二分裂或芽生方式进行繁殖，是目前已知能自行繁殖的最小的原核生物。1961年在美国首次从患有乳腺炎的病牛中分离到牛支原体[2]。1983年国内首次报道从患有乳腺炎的病牛中检出支原体[3]。2008年辛九庆等[4]从患肺炎的犊牛肺中分离出支原体。近年来，在我国贵州、广西、甘肃、宁夏、江西、湖北、安徽、福建、湖南、河南、内蒙古、山东、新疆等地均分离到牛支原体[5～8]。牛支原体可引起牛肺脏组织水肿变性，肺泡、气管及支气管产生炎性浸润[9]。本次病例表现的临床症状与牛支原体肺炎非常相似，经实验室分子生物学检测确诊为牛支原体感染。

5.2巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamutocida，Pm)引起畜禽的1种烈性传染病，可引起牛、猪、鸡、兔等家养动物和野生动物的败血症和呼吸系统疾病[10]。该病在秋、冬季节容易发病，发病急，传播速度快，传播途径多，是危害养殖业健康发展的主要疫病之一。巴氏杆菌依据荚膜抗原的不同和脂多糖抗原的不同分别分为5种血清型(A、B、D、E、F)和16种血清型(1～16)，其血清学分型对于流行病学调查及致病规律的研究具有十分重要的意义。KMT基因为多杀性巴氏杆菌的特异性基因，具有较高的保守性[11]。因此，本试验对病例中分离的细菌选择针对KMT基因设计引物进行PCR鉴定，确定为巴氏杆菌。巴氏杆菌为条件致病菌，如外界环境突变、机体应激反应、免疫力下降等因素容易引起发病。贵州气候多变，昼夜温差大，湿度大，外地牛进入贵州后初期很难适应，容易出现应激反应，免疫力降低，从而增加了巴氏杆菌病的发病率。

5.3对于防治牛支原体和巴氏杆菌感染的基本原则是“防重于治”“早诊断、早治疗”。目前已有牛支原体和巴氏杆菌商品化疫苗，养牛场可以根据疫病的流行情况自行开展疫苗免疫。同时要做好养殖场环境消毒和杀虫灭鼠工作，选择合理治疗药物，交替使用，避免产生耐药性。