鸡传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、鸭源鸡杆菌混合感染病例的病原学诊断

杨 鹏， 陈 静， 尹德晶， 谢晓东， 李乔斌， 岳 筠， 程振涛*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008)

2019年11月，贵州省六盘水市某蛋鸡养殖场出现不明原因死亡病例，病鸡表现呼吸道症状，与鸡毒支原体、鸡传染性喉气管炎等症状相似，为确诊感染病原，特采集病料进行病原分子生物学检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂新城疫病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、鸡传染性喉气管炎普通PCR检测试剂盒、鸡毒支原体普通PCR检测试剂盒、滑液囊支原体普通PCR检测试剂盒，均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker试剂，购自大连宝生物工程有限公司；药敏纸片自制；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 相关病毒核酸检测

1.2.1 新城疫病毒核酸检测采集病鸡脑组织样品，匀浆，反复冻融3次，然后12 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA。以提取的总RNA为模板，构建20 μL RT-PCR反应体系：无菌无核酸酶水2.6 μL，RT-PCR反应液10 μL，酶混合液0.4 μL，荧光探针2.0 μL，模板RNA 5 μL。反应条件： 45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，再循环第2步(60 ℃ 35 s)收集荧光，共40个循环。以阳性对照Ct值≤30 并出现特定的扩增曲线，且阴性对照无Ct值作为实验成立判断标准。

1.2.2 鸡传染性喉气管炎病毒核酸检测采集病鸡喉头组织样品，匀浆，反复冻融3次，然后12 000 r/min 离心10 min，取上清液100 μL，用DNA提取试剂盒提取病毒DNA。以提取的DNA为模板，构建25 μL PCR反应体系：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：ILTV-gB-F：5’-ATCTTTAGAGCAATAG CAGATTTT-3’，ILTV- gB -R：5’-TTATTCGTCT TCGCTTTCTTC-3’。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.3 支原体核酸检测

1.3.1 鸡毒支原体核酸检测采集病鸡气管组织样品，匀浆，反复冻融3次，然后12 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，用DNA提取试剂盒提取支原体DNA。以提取的DNA为模板，构建25 μL PCR反应体系：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：MG-F：5’-ATGAAAGCTAGTATCTATA AA-3’，MG-R：5’-TTATCTTTGGTTGTTAAATT CAG-3’。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸 10 min。 取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.3.2 鸡滑液囊支原体核酸检测采集病鸡关节组织样品，匀浆，反复冻融3次，然后12 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，用DNA提取试剂盒提取支原体DNA。以提取的DNA为模板，构建25 μL PCR反应体系：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 8.5 μL。引物序列：MS-F：5’-GCCATTGCTCC TGCTGTTATA-3’，MS-R：5’-GGGTAGTCCACTCGC ATT-3’。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.4 细菌分离培养鉴定与药物敏感试验(1)无菌操作采集肝脏、心脏、肾脏、脾脏组织样品，划线接种血液琼脂培养基，37 ℃ 24 h进行细菌分离培养，革兰氏染色镜检。(2)将纯化细菌进行16S rRNA PCR扩增及测序，反应体系为：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上、下引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL；引物序列： 16S rRNA-F：5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’，16S rRNA-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察结果并进行测序。测序结果与参考菌株进行同源性比对和遗传进化树分析。(3)应用纸片法对纯化细菌进行药物敏感试验。

2 结果

2.1 病毒核酸检测结果

2.1.1 新城疫病毒核酸检测由图1可见：阳性对照Cq值为25，4份鸡组织样品Cq值为0，提示组织样品中不存在新城疫病毒感染。

2.1.2 鸡传染性喉气管炎病毒核酸检测由图2可见：2份鸡组织样品PCR均扩增出大小为537 bp目的基因片段，与阳性对照片段大小相符，提示组织样品中存在鸡传染性喉气管炎病毒感染。

2.1.3 鸡毒支原体核酸检测由图3可见：2份鸡组织样品PCR均扩增出大小为636 bp目的基因片段，与阳性对照片段大小相符，提示组织样品中存在鸡毒支原体感染。

2.1.4 滑液囊支原体核酸检测由图4可见：2份鸡组织样品PCR均未扩增出目的基因片段，提示组织样品中不存在滑液囊支原体感染。

2.2 细菌分离培养及鉴定结果

2.2.1 细菌分离培养在血液琼脂培养基上生长菌落呈白色、半透明，菌落较小且有溶血现象。

2.2.2 细菌鉴定

2.2.2.1 革兰氏染色镜检钓取菌落革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性，大小形态不一，多为单个或成对的杆状、球杆状、长杆状等多种形态细菌。

2.2.2.2 16S rRNA基因PCR扩增由图5可见：纯化细菌扩增出大小约1 500 bp的16S rRNA基因特异性条带，与预期结果相符。

2.2.2.3 细菌同源性及进化树分析采用Megline软件将分离菌株(GAGZ01株)序列与参考菌株序列进行同源性和系统进化分析，结果显示：分离菌株与10株鸭源鸡杆菌核苷酸同源性较高，在95.8%～96.4%之间，且亲缘关系近(见图6、图7)，因此鉴定分离菌为鸭源鸡杆菌。

2.2.3 药物敏感试验由表1可见：分离菌对硫酸安普霉素、10%氟本尼考、支安(80%延胡索酸泰妙菌素)高度敏感；对福米特(20%替米考星)、联庆(10%硫酸粘菌素)、力奇(10%盐酸多西环素)中度敏感；对新呼畅(50%酒石酸泰乐菌素)低度敏感；对喘速康(10%盐酸大观霉素+5%盐酸林可霉素)、磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林耐药。

表1 分离细菌药敏试验结果

3 结论

通过相关病原核酸检测和细菌分离鉴定，确诊该病例为鸡毒支原体、鸡传染性喉气管炎、鸭源鸡杆菌混合感染。建议该蛋鸡养殖场用敏感抗菌药物联合抗支原体、抗病毒药物控制疫情，抗菌药物定期更换，并做好相关无害化处理及净化工作。

4 讨论

4.1近年来，贵州省大力发展养鸡业，并作为扶贫产业之一。随着养殖发展和养殖方式的变化，鸡病的流行特点日益复杂，混合感染病例逐渐增多。鸡毒支原体主要引起慢性呼吸道病，单纯感染发病所造成的死亡率较低，因此过去对本病不够重视，但感染支原体后造成呼吸道黏膜屏障损伤，易与传染性喉气管炎、新城疫等呼吸道疾病混合感染而加重发病死亡[1，2]。实践证明，对于单纯的支原体感染采用支原净、泰乐菌素、壮观霉素、红霉素有较好的治疗和预防效果[3]。

4.2目前国内对鸭源鸡杆菌的研究不多。鸭源鸡杆菌是鸡体内的常在菌之一，感染主要侵害鸡的呼吸道和生殖系统，是引起蛋鸡腹膜炎、输卵管炎的重要机会菌，该菌对开产后蛋鸡的危害较大，常引起输卵管炎、输卵管囊肿，从而导致产蛋量骤减，蛋品质下降[4，5]。研究表明，鸭源鸡杆菌分离株普遍存在多重耐药性，已成为临床治疗中一个非常棘手的问题[6]。使用抗菌药物前要根据分离菌株的药敏试验结果指导用药，以达到控制感染的目的，并注意抗菌药物交替使用，防止产生耐药性。

4.3对于细菌、病毒等多病原混合感染目前无特效治疗药，应采用相应疫苗积极预防为主、治疗为辅、防治结合、早发现、早治疗为原则的综合性防治措施[7]。同时选择适宜消毒剂，做好带鸡消毒及环境、用具的消毒工作。