一例鸭疫里默氏杆菌病的实验室诊断

刘丽娟， 马光强， 吴良涛， 杨 均， 张海莉， 刘军泽， 陈国权， 王开功， 周碧君*

(1. 贵州省都匀市农业农村局，贵州都匀558000； 2. 黔南民族职业技术学院，贵州都匀558000； 3. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)

鸭疫里默氏杆菌病(Infectious serositis of duck)又称鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemrellaanatipestifer，RA)引起的1种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸭、鹅、火鸡等禽类，临床主要表现眼鼻分泌物增多、喘气、下痢、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等临床症状，以纤维素性心包炎、肝周炎和脑膜炎等为主要病理特征，病死率可高达90%以上[1～3]。RA易产生耐药性，给防治工作带来很大困难，严重危害鸭群健康生长。

2019年9月，贵州省三穗县某养鸭场购进雏鸭5 000余只(未免疫RA疫苗)，饲养至15日龄时出现发病死亡。病鸭主要临床症状：精神沉郁，采食量下降，被毛凌乱，眼角流泪，出现不同程度神经症状，部分鸭头颈歪斜、跛足，死亡后呈角弓反张状。解剖病死鸭可见：肝脏肿大呈墨绿色，肝脏表面有灰白色包膜，肠系膜出血，肠腔肿胀，心包膜纤维素性渗出，肺部淤血肿大等病变。初步怀疑是鸭疫里默氏杆菌感染。为确诊病原，采用细菌分离培养、生化试验、PCR检测进行实验室诊断。现报道如下，供临床参考。

1 材料与方法

1.1 病料选择患病鸭6只，采集心包液、肝脏组织作为检测病料。

1.2 主要试剂及培养基细菌基因组提取试剂盒、2×TaqPCR MasterMix[均购于天根生化科技(北京)有限公司]；DL 2 000 DNA Marker[购于宝生物工程(大连)有限公司]；核酸染料、革兰氏染液(均购于北京索莱宝科技有限公司)；巧克力培养基(实验室自制)；麦康凯琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、微量生化鉴定管、药敏纸片(均购于杭州微生物试剂有限公司)；无菌脱纤维绵羊全血(购于郑州博莱特生物科技有限公司)；新生牛血清(购于浙江天杭生物科技有限公司)；琼脂糖(购于BIOWEST公司)。

1.3 细菌分离培养无菌采集病料心包液、肝脏组织接种于巧克力培养基，置于含5%CO2恒温培养箱37 ℃培养24 h，观察菌落生长情况。无菌挑取单个菌落分别接种于巧克力培养基和麦康凯培养基37 ℃培养24 h。挑取经纯化后的单个菌落于含5%新生牛血清TSB中37 ℃培养24 h。取纯培养物进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态及染色特性。

1.4 细菌鉴定

1.4.1 生化鉴定按照RA生化鉴定图谱，挑取分离菌纯培养物接种于尿素、过氧化氢酶、氧化酶、乳糖、葡萄糖、鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、枸橼酸盐、氨基酸脱羧酶等微量生化管，置于含5%CO2恒温培养箱37 ℃ 培养24～48 h，观察并参照手册判定反应结果。

1.4.2 细菌PCR检测与基因测序无菌吸取分离菌纯培养物2 mL，参照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。根据鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)基因设计特异性引物[4]。上游引物：5’-AGCCAACTATTTGAGACACG-3’；下游引物：5’-ATACCCTTTAATGCTCCTG-3’。预扩增片段663 bp。以该分离菌总DNA为模板，采用25 μL反应体系进行PCR扩增。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 药敏试验采用纸片扩散法(K-B法)对分离菌进行药物敏感性试验。挑取单个纯培养菌落接种于含5%新生牛血清的TSB中，置于恒温振荡培养箱，37 ℃ 180 r/min培养16 h。吸取培养菌液100 μL 均匀涂布于巧克力培养基表面，待表面菌液干燥后用无菌镊子夹取药敏试纸片紧贴于巧克力培养基，置于含5%CO2恒温培养箱37 ℃培养24～48 h后测量抑菌圈直径。参考抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI 2017版)判定结果。

2 结果

2.1 细菌分离培养及形态在巧克力营养琼脂培养基上生长菌落呈圆形、表面光滑湿润、微突起、半透明露滴状(见图1)；麦康凯培养基上无菌落生长。挑取单个菌落进行纯培养，经革兰氏染色镜检，分离菌为革兰氏阴性短小杆菌(见图2)。

2.2 生化试验结果细菌生化试验显示，分离菌不具运动性，尿素、过氧化氢酶、氧化酶试验均为阳性；不发酵乳糖、葡萄糖、蔗糖；不水解鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸脱羧酶；苯丙氨酸、枸橼酸盐、硝酸盐还原、硫化氢、氨基酸脱羧酶试验均为阴性。符合RA生化特性。

2.3 细菌PCR检测与测序鉴定由图3可见，分离菌PCR扩增目的条带单一，为663 bp，与预期一致。

将PCR产物进行测序分析，测序结果与NCBI上公布的序列进行比对，与鸭疫里默氏杆菌OmpA基因同源性达100%，确定分离细菌为RA。

2.4 药敏试验结果由表1可见，分离菌对哌拉西林、卡那霉素、新霉素3种抗菌素高度敏感；对丁胺卡那、四环素、红霉素、多西环素、头孢氨苄、头孢拉啶、头孢呋辛、庆大霉素中度敏感；对羧苄西林、氨苄西林、青霉素、头孢他啶4种抗菌素耐药。

表1 分离菌药敏试验结果

注： S表示高度敏感； I表示中度敏感； R表示耐药

3 结论

通过对养鸭场病例进行实验室细菌分离培养、生化试验、PCR检测及基因测序鉴定，确诊为RA感染。药敏试验发现分离菌对羧苄西林、氨苄西林、青霉素、红霉素、头孢他啶、丁胺卡那、四环素、红霉素、多西环素、头孢氨苄、头孢呋辛、庆大霉素均呈现不同程度的耐药性，仅对哌拉西林、卡那霉素、新霉素3种抗菌素高度敏感。

4 讨论

RA是危害养禽业的重要致病菌之一，多侵害雏鸭，给养鸭业造成巨大的经济损失。目前在我国流行的血清型主要有 1、2、3、4型等10多种[5，6]。由于血清型众多，地域分布广泛，RA的耐药现象越来越严重，部分地区的RA多重耐药现象也越来越普遍，防治较困难。为避免该病的发生，养禽场要加强饲养管理，严格做好消毒、接种、检疫等工作[7]。本试验结果可为该养鸭场及贵州RA流行地区防治用药提供参考。