视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ在抗禽源病毒先天免疫中的作用研究进展

王 娜， 陈国权， 程振涛，3， 文 明，3， 王开功，3， 周碧君，3*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025； 2. 贵州大学动物疫病研究所，贵州贵阳550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025)

先天性免疫系统(Innate immune system，IIS)是动物机体抵抗病原微生物感染和侵害的第1道防线。在感染初期，机体通过模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRS)可以识别病原微生物侵入机体后复制过程中产生的一些保守组分，即病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，引起抗病原微生物免疫反应[1]。先天免疫反应是诱导Ⅰ型干扰素 (type Ⅰ interferons，ⅠIFNs)、促炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)与趋化因子(chemokines)的表达而启动，使感染细胞和邻近的未感染细胞产生免疫反应，限制病原微生物的扩散，从而抑制其复制[2～4]。目前发现的PRRS主要包括Toll受体(Toll like receptors，TLRs)、RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)、NOD样受体(NOD like-eceptors，NLRs)和DNA受体[5]。视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)已被鉴定为病毒核酸的细胞质传感器[6]。现将RIG-Ⅰ的结构、参与病毒识别、抗新城疫病毒(NDV)与禽流感病毒(AIV)感染的先天免疫作用介绍如下。

1 RIG-Ⅰ及其结构

RIG-Ⅰ又名DDX58(DEAD box polypeptide，DDX58)，参与机体的先天免疫反应，由我国学者于1997年从人急性早幼粒白血病NB4细胞株中分离。RIG-Ⅰ由2个N端CARD结构域、1个DexH/D-box解旋酶结构域和1个C端调控域(RD)构成。RIG-Ⅰ解旋酶属于SF2类解旋酶，包括Hel1和Hel2及中间的Hel2i[7，8](见图1)。RIG-Ⅰ通过其N端的CARD结构域与其他含有CARD结构域的蛋白相互作用，招募下游信号分子，启动信号级联反应[9]。

2 RIG-Ⅰ对病毒的识别

当病原侵入机体时，机体能否精准有效启动自身的免疫反应取决于是否准确识别自身与非自身成分。RIG-Ⅰ的表达谱十分广泛，但主要在非髓系细胞，如成纤维细胞、巨噬细胞和常规树突细胞(cDCs)胞浆中发挥抗病毒作用。RIG-Ⅰ对病毒具有选择性识别作用，可识别病毒的dsRNA 5’三磷酸(5’-ppp)结构。宿主RNA在转录过程中可产生含7-甲基鸟嘌呤的5’-ppp帽子结构，RNA上暴露的5’-ppp 成为病毒核酸的典型特征。其次，病毒mRNAs的5’-ppp缺乏典型的2’-0-2甲基，胞质宿主受体可识别这种mRNAs。因此，受体可借此识别非自身RNA分子[10～12]。RIG-Ⅰ对病毒的识别与病毒所产生的dsRNA的长度有关，RIG-Ⅰ可识别RNA长度较短(1.2～1.4 kb)的RNA病毒[13，14]。

3 RIG- Ⅰ 抗病毒感染的先天免疫作用

在使用视黄酸治疗急性早幼粒细胞白血病时，细胞中RIG-Ⅰ被诱导[15]。目前已有报道其作为抗病毒蛋白的作用[16]。哺乳动物RIG-Ⅰ已被证明可通过识别病毒基因组RNA上端的5’-ppp来识别大多数RNA病毒。敲除小鼠中的RIG-Ⅰ，发现其在抗病毒先天免疫中起着重要的作用，其机制不同于TLR3介导的抗病毒应答。通过NDV与AIV感染RIG-Ⅰ缺失小鼠，干扰素(IFN)表达受到抑制，而用相同病毒感染黑色素瘤分化相关基因5(melanma differentiation associated gene 5，MDA5)缺失小鼠时，IFN表达则不会受到抑制，说明IFN的产生依赖RIG-Ⅰ[17]。

3.1RIG-Ⅰ抗AIV作用鸭是AIV的天然储存库，可抵抗对鸡具有致死性的高致病性AIV的感染[18]。大多数AIV毒株在鸭体内复制，包括16种血凝素(HA)亚型和9种神经氨酸酶(NA)亚型[19]。由于鸭感染禽流感(Avian Influenza，AI)几乎不发病，因此将禽流感分为高致病性或低致病性是指对鸡的感染[20]。高致病性禽流感可能在1～3 d之内引起鸡死亡，而低致病性禽流感仅引起轻度疾病现象[21，22]。AIV毒株可以在鸡体中复制，并且可以从低致病性演变为高致病性[23]。高致病性的H5N1毒株普遍对鸡具有致死性，但在其天然宿主中通常仅为无症状感染和很少的病理现象[24]。研究发现，鸭存在具有完整的功能性鸭RIG-Ⅰ(duRIG-Ⅰ)，而鸡缺乏该受体的基因。对RIG-Ⅰ样受体的系统发育分析也表明，鸡中不存在RIG-Ⅰ，因此RIG-Ⅰ缺失可能是鸡对AIV敏感的基础[25，26]。通过研究组织表达谱表明，在未感染AIV的鸭大多数组织中，duRIG-Ⅰ仅以低度或中等水平表达，这与人的正常组织或细胞中RIG-Ⅰ的弱表达相一致[25]。Toll样受体7(TLR7)和RIG-Ⅰ受体是AIV的主要检测器，尽管TLR7负责白细胞产生α干扰素(IFN-α)，但最初感染AIV的细胞中胞质检测涉及RIG-Ⅰ[27]。转染AIV后，鸭体内RIG-Ⅰ的表达在早期提高了200倍，表达量显著提高[18]。AIV非结构蛋白1(NS1)能有效地抑制RIG-Ⅰ活性，从而干扰IFN途径的激活，但NS1对RIG-Ⅰ活性的抑制具有特异性[28]。

鸡具有MDA5受体，其在IPS-1/MAVS/CARDIF的下游使用与RIG-Ⅰ相同的信号传导途径[18]。鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)不能响应RIG-Ⅰ配体5’-pppRNA，然而用duRIG-Ⅰ转染DF-1细胞来重构该途径(RIG-Ⅰ信号传导)后，转染duRIG-Ⅰ可以在鸡细胞中诱导针对H5N2和H5N1的抗病毒反应[29]，DF-1细胞中duRIG-Ⅰ的存在降低了H5N2和H5N1毒株的滴度。另一方面，RIG-Ⅰ刺激了β干扰素(IFN-β)的产生，协调抗病毒干扰素刺激基因(ISGs)启动抗病毒反应[30]。在鸭体中发现的这种天然抗病毒基因可以通过创建转基因鸡来提高鸡对AIV的抵抗力。

3.2RIG-Ⅰ抗NDV作用NDV引起的新城疫(newcastle disease，ND)是家禽和野禽的严重疾病之一，感染后死亡率和发病率高，给养殖业造成巨大经济损失。尽管现已使用疫苗预防，但许多国家和地区仍经常报道有ND暴发[31，32]。NDV已知有大量宿主，可通过实验或自然途径感染至少250种鸟类，不同种的鸟类在感染特定NDV后表现出不同的致病性[33]。而鹅对NDV具有很高的抗感染能力[18，19]。研究发现存在鹅RIG-Ⅰ(gRIG-Ⅰ)，可通过PCR扩增长2 805 bp的gRIG-Ⅰ，表现出与鸭RIG-Ⅰ具有93.8%的氨基酸同源性。IFN表达的增加与gRIG-Ⅰ转染的细胞中病毒滴度的降低相关，这表明gRIG-Ⅰ可通过先天免疫赋予细胞抗病毒活性[34]。单独的哺乳动物CARD结构域是1种组成性活性分子，不需要配体即可发挥功能，CARD结构域传递“下游”信号，导致转录因子的激活，随后诱导细胞的抗病毒功能，包括干扰素的产生[35]。单独转染gRIG-ⅠCARD结构域可以剂量依赖性方式增强IFN启动子活性。用gRIG-Ⅰ与空载体转染DF-1细胞，发现gRIG-Ⅰ转染的DF-1细胞中γ干扰素(IFN-γ)启动子活性增强[34]。

低毒力病毒株会诱导gRIG-Ⅰ高水平表达，gRIG-ⅠmRNA与病毒毒力之间存在负相关，NDV感染后这种相关性得以维持，这与NDV蛋白对RIG-Ⅰ信号的抑制有关。甲型流感病毒和丙型流感病毒的NS1通过靶向抑制RIG-Ⅰ信号传导来拮抗宿主抗病毒[28]。因此，NDV viral蛋白可能在破坏RIG-Ⅰ信号传导中发挥作用，并且这种情况可能因不同的NDV毒株而异。不同组织和NDV毒株的毒力强弱决定gRIG-ⅠmRNA表达水平。细胞通过上调gRIG-ⅠmRNA表达水平和降低病毒滴度来抵抗NDV感染，并在依赖IFN的抗病毒先天免疫中发挥重要作用[36]。

4 小结

病毒PAMPs被动物机体的TLRs和RLRs识别，激发一系列炎症信号通路，病毒感染动物后RIG-Ⅰ在体内表达量增加并诱导IFN的产生。这些研究结果为禽类对NDV和AIV感染具有先天免疫的机理提供了一些见解，然而关于先天免疫机制还有待深入探索。在较为复杂的分子网络中，深入了解动物机体内RIG-Ⅰ如何在抗病毒先天免疫中发挥作用能帮助我们更好地理解先天免疫作用，为治疗相关疾病提供新的思路。