LA16c-313D11.11与miR-205-5p在子宫内膜癌中的表达及意义

韩雪松 丁雪 赵鹏 于辉 辛卫娟★

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，是女性生殖系统常见的肿瘤，随着女性生活饮食行为习惯的改变，每年的新发病例呈迅猛上升趋势，在我国已成为仅次于宫颈癌的导致死亡的常见妇科恶性肿瘤[1]。子宫内膜癌的发病原因迄今尚不明确，许多研究证明其涉及除雌孕激素外的许多其他分子通路及机制[2]。近年来大量国内外研究指出子宫内膜癌的发生和发展与非编码RNA 密切相关[3-5]。研究表明MicroRNA（miRNA）是mRNA 编码蛋白质的调节因子，对基因表达、细胞分化、凋亡乃至个体发育产生重要影响，其中miR-205-5p 在子宫内膜癌的发生发展中发挥了重要的调控作用，有文献报道LncRNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）对miRNA有内源竞争抑制作用[6]。本实验前期研究在含有miR-205-5p 结合位点的LncRNA 中筛选出在子宫内膜癌组织中表达下调的LncRNA-LA16C-313D11.11，并证实其与miR-205-5P 具有竞争抑制作用[7]。但其在子宫内膜癌中的具体作用尚未可知，本研究旨在明确LA16c-313D11.11和miR-205-5p 在子宫内膜癌中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年1月至2016年2月在复旦大学附属妇产科医院进行手术的子宫内膜癌手术标本60例。患者年龄26～76岁，中位年龄55岁。收集同期子宫内膜非典型增生组织20例（患者年龄37～53岁，中位年龄47岁）和正常子宫内膜组织20例（患者年龄49～61岁，中位年龄49岁）作为对照组，正常子宫内膜组织来源于因子宫良性疾病（如子宫脱垂或子宫肌瘤等）行子宫切除术后证实子宫内膜组织正常者。3组年龄有可比性。纳入标准：患者术前均未行化疗、放疗或激素治疗且均签署知情同意书。排除标准：患者术前曾接受激素或放化疗治疗且未签署知情同意书者。

1.2 方法

实时荧光定量qRT-PCR 检测LA16c-313D11.11和miR-205-5p 表达情况按照Trizol（Invitrogen，USA）试剂盒说明书进行细胞总RNA 提取，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。反转录使用Prime ScriptTM RT试剂盒（Takara，Japan），按说明书操作。采用Primer5.0软件设计引物。LA16c-313D11.11 引物：上游5′-TGAAGGA GGTTATTGACGCA；下 游：5′-GAGGGGAAACAGTCCAGAGT。miR-205-5p 引物：上游：5′-TCCACCGGAGTCTGTCTCAT；下游：5′-GCTGTCAACGATACGCTACG。GAPDH 引物：上游：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3；下游：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。采用SYBR Premix ExTaq TM试剂盒（Takara，Japan）和Rotor-Gene3000 系统进行实时荧光定量PCR反应及测定。每个反应设3个复孔。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计数资料用n（%）表示，行χ2检验，计量资料用（）表示，两组间用独立样本t检验，多组间采用单因素方差分析方差不齐者采用非参数检验，相关性分析用等级资料Spearman 秩相关，以r=0 作为判断相关性的标准。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组病理检查结果

LA16c-313D11.11和miR-205-5p 在不同子宫内膜组织中的表达情况。见图1。

LA16c-313D11.11 在正常组织、EAH 组织及子宫内膜癌组织中的表达结果为EC组最低，其次为EAH 组，最高是正常组，3组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-205-5p 的表达在正常组织、EAH 组织及子宫内膜癌组织中表达结果为EC组最高，其次是EAH 组，最低是正常组，3组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.2 LA16c-313D11.11和miR-205-5p 的表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系

以中位值作为截断，将表达量大于等于中位值的LA16c-313D11.11 定义为高表达组，表达量小于中位值定义为低表达组。发现LA16c-313D11.11 低表达与FIGO 晚期及淋巴结转移有显著相关（P＜0.05）。结果表明，低表达LA16c-313D11.11 与更具侵袭性的子宫内膜癌表型相关，miR-205-5p 的表达也与FIGO 分期及淋巴转移相关（P＜0.05）。见表1。

2.3 LA16c-313D11.11与miR-205-5p表达的相关性

在正常子宫内膜组织和EAH 中LA16c-313D11.11和miR-205-5p 的表达，差异无统计学意义（P＞0.05）。在EC组中Spearman 相关分析呈现负性相关（P<0.05，rs＝-0.305）。见表2。

表1 LA16c-313D11.11/miR-205-5p 表达与肿瘤临床病理指标的关系[n（%）]Table1 Association of LA16c-313D11.11 and miR205-5p expression with the clinicopathological characteristics of patients with EC[n（%）]

3 讨论

miRNA是内源性的大小在20～25 nt 的一类非编码RNA，在细胞核内转录成70～100 nt 的双链发夹状前体RNA 并经过Dicer 酶和Drosha 酶的分步切割，进入RISC 复合体中，通过与靶mRNA 的3′端非编码区（3′-UTR）不完全配对结合，在转录后水平抑制靶mRNA 表达或介导靶mRNA 降解。miRNA 最早于1993年在线虫身上发现[8]，后续研究阐明其参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖，甚至肿瘤发生[9-11]。Daikoku 等[10]在小鼠子宫内存在于所有的多细胞生物中，同时具有一定的保守性，提示其在多种生物反应过程中膜癌标本中发现miR-199a、miR-101a下调。Todd 等[12]在对正常子宫内膜、不典型增生内膜及子宫内膜癌的研究中，发现了13个差异表达显著的miRNA，其中下调的miRNA 5个（1et-7i，miR-221，miR-193，miR-152，miR-30c），上调的miRNA 8个（miR-185，miR-106a，miR-181a，

表2 LA16c-313D11.11 与miR-205-5p 在不同子宫内膜组织中表达的相关性Table2 correlation between LA16c-313D11.11 and miR-205-5p expression in different endometrial tissues

miR-210，miR-423，miR-103，miR-107，let-7c）。Loffe YJ 等[13]研究发现在子宫内膜癌细胞株AN3CA和KLE 中miR-19b、miR-20a、miR-21、miR-26a 高表达。Lee H 等[14]在对正常子宫内膜、异常增生子宫内膜及子宫内膜癌组织的研究中发现miR-182、miR-183、miR-200a、miR-200c和miR-205 在子宫内膜癌中高表达。Karaayvaz M 等[15]对正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中的miR-200c和miR-205-5p 的表达水平进行检测，结果发现miR-205-5p 不仅可以作为子宫内膜癌诊断的一个有效标志物，而且能预测子宫内膜癌患者的临床预后。

LncRNA是一类长度介于200 nt～100 kb 之间的非编码RNA，位于细胞核和细胞质中，在真核细胞中普遍被转录。越来越多的证据表明，LncRNA与癌症的发生存在密切的关系[16]。LncRNA 差异表达于正常组织与其相应不典型增生的组织及肿瘤中，而且特异性LncRNA 可作为肿瘤的预测因子[17]。Gibb 等[18]从人类正常组织到人类癌组织描写LncRNA 转录谱，在癌症中存在异常的LncRNA表达谱。应激介导长链非编码转录体5（long stressinduced non-coding transcript-5，LSINCT5）是一个在细胞核集中分布，大小为2.6 kb 的多聚腺苷酸，相对于正常的组织，LSINCT5 在乳腺癌和卵巢癌细胞系及肿瘤组织中存在过量表达，敲除LSINCT5 能明显抑制癌细胞增殖并伴随多种基因的表达下调，推测LSINCT5 可能是通过调节下游的靶基因，促进癌细胞增殖，发挥致癌作用[19]。Gloss 等[20]研究发现了一个潜在的卵巢癌的表观遗传标志物LOC134466，研究显示该LncRNA 在II型浆液性卵巢癌CpG 岛存在高达81%甲基化（81/100），而其它不同类型卵巢癌仅为7.7%（1/13），因此认为该标志物对II型浆液性卵巢癌诊断具有潜在价值。LncRNA-MALAT1通过调节基因表达影响宫颈癌细胞生长和细胞转移[21]。Akrami 等[22]研究发现在浆液性卵巢腺癌中位于1号染色体上的LncRNA-OVAL 转录激活，同样的现象发生在包括子宫内膜癌在内的其他16种癌症中。这说明体细胞LncRNA 可以特别针对人类基因组扩增，发挥作用参与肿瘤的发生或发展。

综上所述，本研究阐明了LA16c-313D11.11 对子宫内膜癌增殖侵袭的影响，以及在子宫内膜癌中LA16c-313D11.11 可能通过内源竞争抑制miR-205-5p 发挥作用，这将为子宫内膜癌的治疗提供更有效的思路。后续研究我们将进一步明确其作用机制，从而对子宫内膜癌的诊断和治疗提供新的依据。