miR-93-5p对心脏成纤维细胞纤维化的影响

张伟峰 雷素扬 赵俊涛

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一种危害人类健康的重要心血管疾病，被称为发达国家的“头号杀手”[1]。随着发展中国家的经济发展，这种疾病也呈现逐年升高的趋势。尽管近年来在治疗方面取得了进展，但心肌梗死患者随后发生缺血和死亡的风险仍在增加。因此，开发一种新的高效治疗方案具有重要意义。miRNA，一种长度仅在18～22个核苷酸的内源性，高度保守的微小分子，其通过沉默靶基因的转录和翻译过程在人类多种疾病中发挥调控作用[2-3]。且miRNA 也参与了机体多个器官如心脏、肺脏、肾脏、肝脏、皮肤的纤维化过程[4]。miR-93-5p是近2年在心肌梗死中新发现的失调miRNA 之一[5]，其在心肌梗死中的功能及机制尚未十分清楚。弗林蛋白酶（Furin）是一种高度特异性的丝氨酸内切蛋白酶，归属于前蛋白转化酶（proprotein convertases，PC）家族，其在心脏的发育、生长及结构重塑中具有重要作用[6-7]。我们推测miR-93-5p 与Furin 在心肌梗死过程中的成纤维细胞纤维化中具有联系。本研究旨在探讨miR-93-5p 调控心脏成纤维细胞纤维化的功能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

心肌梗死模型小鼠购自上海百致生物医药科技有限公司；杜氏培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）购自Gibco公司；pcDNA3.1-EGFP 载体购自上海振誉生物科技有限公司；pmir-GLO 载体购自上海钰博生物科技有限公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链免疫反应（Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain immune reaction，qRT-PCR）试剂盒和反转录试剂盒均购自日本TaKaRa；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega；电化学发光（electronics components laboratory，ECL）试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。实验中涉及的引物及序列均有上海吉玛公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离、培养和处理

使用开胸法无菌摘取小鼠心脏，去除结缔组织，用胰酶消化，收集细胞悬液。用新鲜含有10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，再使用差速贴壁法将细胞在培养箱中培养2 h。其中贴壁细胞为心肌成纤维细胞，未贴壁的细胞为心肌细胞。将细胞常规培养至3～4 代后用于后续实验。将心肌成纤维细胞标记为CF组，心肌细胞标记为CM组。使用脂质体对CF细胞进行处理，具体的处理方法为：取3～4倍的质粒或DNA 量的脂质体进行转染，miR-NC组（转染miR-NC）、miR-93-5p mimic 组（转染miR-93-5p mimic）、inhibitor-NC组（转染inhibitor-NC）、miR-93-5p inhibitor 组（转染miR-93-5p inhibitor）、pcDNA组（转染pcDNA）、pcDNA-Furin 组（转染pcDNA-Furin）、si-NC组（转染si-NC）、si-Furin 组（转染si-Furin）、miR-93-5p mimic+pcDNA组载体（共转染miR-93-5p mimic和pcDNA）、miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 组（共转染miR-93-5p mimic和pcDNA-Furin），将其转染8 h 后，弃去培养基，用新培养基再培养48 h，用qRTPCR 验证转染是否成功，将转染成功的细胞用于后续试验。若转染不理想，需要调整转染条件，更换质粒，进行重新转染，直至转染成功，才可用于后续实验。

1.2.2 qRT-PCR 检测细胞中miR-93-5p、Furin 的表达

详细步骤参考文献[6]，miR-93-5p、Furin 以U6、GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-93-5p、Furin 的相对表达。引物信息（5′-3′）：miR-93-5p，上游引物GCCATGTAAACATCTCGGACTG，下游引物CAATGCGTGTGGTGGAGGAG；U6，上游引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT；Furin 上游引物CCAGAGCGCCCTTTGAAA，下游引物CCAGTCGCAAGATAAAAAAATACTTTG；GAPDH，上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG，下游引物 TGCCATGGGTGGAATCATATTGG；PCR 条件：95℃15 min，94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s，共40个循环。

1.2.3 Western blot 检测细胞中Furin、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表达

用0.25 %胰酶消化、收集细胞，用蛋白裂解液充分将其裂解。然后进行总蛋白的提取，定量和变性。用变性后的蛋白上清液进行蛋白电泳上样，结束后将蛋白从胶上转移至PVDF 膜。然后将膜进行倍比稀释的相应一抗（1∶500～1 500）溶液中孵育过夜（4℃）。取出膜，将其浸入相应倍稀释的二抗（1∶1 000）溶液中孵育2 h（37℃）。最后，用ECL显色液进行显影、曝光，将图片用Quantity One 4.62 软件进行分析，用目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值表示蛋白的表达。

1.2.4 双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性

构建包含miR-93-5p 结合位点的Furin 野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-Furin、MUTFurin，将其分别与miR-NC、miR-506-3p 共转染至CF 细胞，转染48 h，按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.2.5 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以（）表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-93-5p、Furin 在心肌成纤维细胞中的差异表达

运用qRT-PCR和Western blot 检测CM、CF 细胞中miR-93-5p、Furin 的表达情况。与CM 组相比，CF 组细胞中miR-93-5p mRNA 表达显著升高，Furin 的mRNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 miR-93-5p、Furin在心肌成纤维细胞中的差异表达（±s）Table1 Differential expression of mir-93-5p and furin in cardiac fibroblasts（±s）

表1 miR-93-5p、Furin在心肌成纤维细胞中的差异表达（±s）Table1 Differential expression of mir-93-5p and furin in cardiac fibroblasts（±s）

组别CM 组CF 组t值P值miR-93-5p mRNA 1.01±0.06 1.28±0.11 6.464 0.000 Furin mRNA 1.00±0.08 2.54±0.15 27.176 0.000 Furin 蛋白0.99±0.07 1.53±0.11 12.424 0.000

2.2 miR-93-5p对成纤维细胞纤维化的影响

与miR-NC组相比，miR-93-5p mimic 组心肌成纤维细胞中miR-93-5p mRNA 表达显著升高，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表达均显著降低；与inhibitor-NC组相比，miR-93-5p inhibitor 组心肌成纤维细胞中miR-93-5p mRNA 表达显著降低，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 miR-93-5p 调控成纤维细胞纤维化相关蛋白的表达（±s）Table2 miR-93-5p regulates the expression of fibrosis related proteins in fibroblasts（±s）

表2 miR-93-5p 调控成纤维细胞纤维化相关蛋白的表达（±s）Table2 miR-93-5p regulates the expression of fibrosis related proteins in fibroblasts（±s）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与inhibitor-NC组比较，bP＜0.05。

组别miR-NC组miR-93-5p mimic 组inhibitor-NC组miR-93-5p inhibitor 组F值P值miR-93-5p mRNA 1.02±0.07 2.94±0.16a 0.97±0.06 0.20±0.12b 681.816 0.000蛋白CollagenⅠ0.99±0.08 0.67±0.05a 0.96±0.07 1.68±0.14b 197.784 0.000 CollagenⅢ1.02±0.08 0.77±0.06a 0.98±0.07 1.37±0.12b 76.054 0.000 TIMP2 1.01±0.09 0.52±0.04a 0.96±0.05 1.67±0.13b 278.185 0.000 Fibronectin 1.00±0.08 0.42±0.03a 0.99±0.08 1.71±0.13b 320.894 0.000

2.3 miR-93-5p 靶向Furin

通过Stabase 2 软件预测到Furin 可能是miR-93-5p 的靶基因（图1A）；双荧光素酶实验结果见表3，miR-93-5p mimic 组相较于miR-NC组可显著降低Furin-WT 细胞的荧光素酶活性，miR-93-5p inhibitor 组相较于inhibitor-NC组可显著升高Furin-WT细胞的荧光素酶活性；Western blot 检测显示，miR-93-5p mimic 组相较于miR-NC组Furin 蛋白表达显著降低，miR-93-5p inhibitor组相较于inhibitor-NC组Furin 蛋白表达显著升高（P＜0.05），见表3和图1B。

2.4 Furin 对成纤维细胞纤维化的影响

与pcDNA组相比，pcDNA-Furin 组细胞中Furin mRNA和蛋白表达均显著升高，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表达均显著升高；与si-NC组相比，si-Furin 组细胞中Furin mRNA和蛋白表达均显著降低，CollagenⅠ、Colla-genⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。见表4。

表3 miR-93-5p 靶向Furin（±s）Table3 miR-93-5p targeting furin（±s）

表3 miR-93-5p 靶向Furin（±s）Table3 miR-93-5p targeting furin（±s）

注：与miR-NC组比较，aP＜0.05；与inhibitor-NC组比较，bP＜0.05。

组别miR-NC组miR-93-5p mimic 组inhibitor-NC组miR-93-5p inhibitor 组F值P值荧光活性Furin-WT 0.99±0.08 0.27±0.02a 0.99±0.06 1.77±0.12b 517.655 0.000 Furin-MUT 1.00±0.06 0.98±0.09a 0.97±0.08 1.02±0.10b 0.629 0.601 Furin蛋白1.00±0.08 0.68±0.06a 0.97±0.07 1.49±0.12b 138.634 0.000

表4 Furin 对成纤维细胞纤维化的影响（±s）Table4 Effect of furin on fibroblast fibrosis（±s）

表4 Furin 对成纤维细胞纤维化的影响（±s）Table4 Effect of furin on fibroblast fibrosis（±s）

注：与pcDNA组比较，aP＜0.05；与si-NC组比较，bP＜0.05。

组别pcDNA组pcDNA-Furin 组si-NC组si-Furin 组F值P值Furin mRNA 1.00±0.05 1.95±0.12a 0.99±0.06 0.32±0.03b 755.943 0.000蛋白Furin 1.02±0.09 1.64±0.09a 0.96±0.07 0.72±0.06b 224.016 0.000 CollagenⅠ1.01±0.08 1.82±0.15a 0.99±0.09 0.67±0.06b 213.243 0.000 CollagenⅢ1.00±0.08 1.49±0.13a 0.99±0.08 0.70±0.06b 116.072 0.000 TIMP2 1.02±0.09 1.55±0.12a 1.01±0.07 0.68±0.05b 155.919 0.000 Fibronectin 0.97±0.09 1.44±0.12a 0.99±0.08 0.52±0.04b 166.583 0.000

2.5 Furin 回复miR-93-5p对成纤维细胞纤维化的调控作用

与miR-93-5p mimic+pcDNA组相比，miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 组细胞中miR-93-5p mRNA表达显著降低，CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。见表5。

表5 Furin 回复miR-93-5p对成纤维细胞纤维化的调控作用（±s）Table5 Regulatory effect of furin on fibroblast fibrosis by recovering miR-93-5p（±s）

表5 Furin 回复miR-93-5p对成纤维细胞纤维化的调控作用（±s）Table5 Regulatory effect of furin on fibroblast fibrosis by recovering miR-93-5p（±s）

注：与miR-93-5p+pcDNA组比较，aP＜0.05。

组别miR-93-5p mimic 组miR-93-5p mimic+pcDNA组miR-93-5p mimic+pcDNA-Furin 组F值P值蛋白miR-93-5p mRNA 1.02±0.08 0.99±0.09 0.76±0.06a 30.182 0.000 CollagenⅠ0.99±0.08 1.02±0.09 1.23±0.10a 18.844 0.000 CollagenⅢ1.00±0.08 0.98±0.09 1.31±0.11a 34.748 0.000 TIMP2 0.98±0.08 1.00±0.07 1.43±0.09a 89.953 0.000 Fibronectin 1.01±0.08 0.97±0.08 1.52±0.10a 111.355 0.000

3 讨论

miRNAs 在心肌梗死的发生、发展过程中起着关键的作用[8]，但是miR-93-5p 在心肌梗死中的功能仍有待进一步开发。Liu 等[9]在研究中发现，包含miR-93-5p 的脂肪间充质干细胞（adipose-derived stromal cells，ADSC）外泌体能够显著的增强单纯使用ADSC 对急性心肌梗死大鼠的心肌治疗作用，并且这种机制与miR-93-5p 可分别通过靶向自噬相关基因（recombinant autophagy related protein 7，Atg7）和Toll 样受体4（toll like receptor，TLR4）来抑制缺氧诱导的自噬和炎性细胞因子的分泌相关。Li 等[10]报道，miR-93 在冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）患者血液中升高，但其可抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤，但在抑制miR-93 的小鼠模型中，能够加速心脏重塑的恶化。Zhong 等[11]在急性心肌梗死组织的差异miRNA 分析中报道，miR-93-5p 的表达异常升高。

Furin是一种分泌型前蛋白转化酶，可通过在一个或多个内部位点进行有限的蛋白水解，将前体蛋白激活为生物活性形式[12]。其参与多种蛋白质前体的成熟，包括生长因子、跨膜受体、内分泌激素和粘附分子[13]。Furin 的多种潜在底物与心脏分化和发育的不同方面有关，例如，骨形态发生蛋白4抗体（bone morphogenetic protein 4，Bmp4）对于流出道（outflow tract，OFT）和房室（atrioventricular，AV）分隔是必需的，并受Furin 影响[14]。此外，携带突变的小鼠破坏了proBmp4 对Bmp4 的有序分裂，表现出发育异常，包括心血管缺陷[15]。王珏等[16]报道，在心脏成纤维细胞中，Furin 作为miR-24 的靶标，参与小鼠心脏成纤维细胞的胶原合成、增殖、迁移过程。本实验发现，Furin 在大鼠心脏成纤维细胞中表达上调，并且下调Furin 能够抑制心脏成纤维细胞中纤维化相关蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP2、Fibronectin 的表达，而上调Furin 则具有相反的作用。这些实验结果均与上述前人的研究结果相吻合。miR-93-5p和Furin 在心肌梗死成纤维细胞中的表达虽都为上调，但是二者发挥的功能是相反的，这可能与机体在疾病发展的不同阶段具有不同的生理病理学特性有联系，发生这种作用的机制可能还与其他因素（miRNA 的调控网络）相关，这有待进一步的深入研究。

综上所述，miR-93-5p 具有抑制心脏成纤维细胞纤维化的作用，其机制与靶向抑制Furin 有关，为心肌梗死的治疗提供新靶点。