高效液相色谱法测定附子理中丸中6-姜辣素的含量

潘海霞，王晓琦，武红娜

（沧州市食品药品检验所，河北 沧州 061000）

附子理中丸于2009年载入《国家基本药物目录》，是甲类处方药，临床应用广泛。其处方出自宋代的《太平惠民和剂局方》，由附子（制）、党参、炒白术、干姜、甘草5味药组方而成[1-5]。干姜是附子理中丸方中君药[5]，6-姜辣素为其有效成分，具有抗胃溃疡、止吐的药理作用[6-8]，与附子理中丸脾胃虚寒、呕吐泄泻的功能相对应，可在一定程度上反映该药的功效。6-姜辣素性质不稳定，不同产地、不同采收季节干姜中6-姜辣素含量会有所变化，生产过程中容易造成6-姜辣素成分流失[9-11]。因此选择6-姜辣素作为附子理中丸检验的新指标。《中国药典》2015年版一部为该药的法定标准，标准中仅对干姜进行了显微鉴别和薄层色谱鉴别，而6-姜辣素并未进行监测，故本文拟定建立高效液相色谱法（HPLC）对6-姜辣素含量进行检验，以期控制附子理中丸的药品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；CP225D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；LC350A型超声波处理器（鲁超超声设备有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

6-姜辣素对照品（批号：111833-201806，含量以99.9 %计，-20 ℃保存，中国食品药品检定研究院）；甘草、白术、党参对照药材（批号分别为：120904-201620，120925-201812，121057-201206，供鉴别用），均购自中国食品药品检定研究院；附子对照药材（批号为PCS8186，供鉴别用），购自北京中科质检生物技术有限公司；附子理中丸来自不同厂家、3种剂型共计15批次；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水（自制），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 588935-902 TC-C18（2）（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（30:25:45），等度洗脱；流速：0.8 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量10 μl。理论板数按6-姜辣素计算不低于5000，色谱峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品水蜜丸适量，研细，取约2.2 g，精密称定，或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取约3.2 g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入75 %乙醇20 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率30 kHz）25 min，放冷，用75 %乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按附子理中丸（浓缩丸）处方及工艺制备缺少干姜的阴性样品，并按2.2.2项下供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，依据2.1项下色谱条件测定，结果见图1。供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液的色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间处无干扰。

图1 6-姜辣素的HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 取6-姜辣素对照品适量，精密称定，加适量甲醇制成浓度分别为0.04，0.06，0.10，0.20，0.30 mg/ml的溶液，分别精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 µl，按照2.1项下色谱条件测定。以峰面积（y）对浓度（x，mg/ml）进行线性回归，得回归方程为：y=5706.5x+22.048，相关系数r=0.9986。结果表明，6-姜辣素在0.04～0.30 mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.3 溶液稳定性 将供试品溶液（2号企业，批号为180101）分别于配置后在室温下放置0，2，4，8，12和24 h，依法测定其峰面积，结果6个检测点6-姜辣素的峰面积的RSD为0.4 %，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 精密度试验 取2.2.1项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测得6-姜辣素峰面积的RSD为0.7 %，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同批号样品，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液（2号企业，批号为180101），按2.1项下色谱条件测定。结果，样品中6-姜辣素平均含量为4.5 mg/丸，RSD为1.27 %（n=6），结果表明该方法的重复性良好。

2.3.6 回收率测定 取已知含量的样品（2号企业，批号为180101）约3.2 g，精密称定，分别按样品含量的50 %，100 %，150 %加入6-姜辣素对照品，按2.2.2项下方法制备成供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，测得6-姜辣素的回收率范围为97.75 %～102.58 %，平均回收率为99.43 %，RSD为1.5 %，结果表明加样回收率良好。

表1 回收率试验结果

2.4 样品测定

取15批样品（大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算6-姜辣素含量。结果见表2。由表2可见，3种剂型附子理中丸6-姜辣素含量差异较大，作为药品的活性成分，亟待制定标准进行质量控制。

3 结论与讨论

3.1 试验结果分析

不同剂型、厂家样品中6-姜辣素含量有明显差异。分析原因：一是原药材质量较差，不同产地、不同采收季节干姜中6-姜辣素含量会有所变化；二是工艺方面，水蜜丸在制丸干燥或灭菌过程中均有可能造成6-姜辣素成分流失。

3.2 提取溶剂的选择

分别采用75 %乙醇、75 %甲醇、乙醇、甲醇、水进行提取，发现75 %甲醇提取较完全，且峰形较好，稳定性好，保留时间适中，考虑到实验效率和效果及仪器的稳定状态等综合因素，确定使用75 %甲醇为溶剂。

表2 样品测定结果

3.3 提取方式的考察

分别采用了75 %甲醇溶解，超声15，20，40 min，振摇50，40，30 min，放置24 h，发现超声20 min至40 min与振摇30 min提取比较完全，但随超声时间的延长，6-姜辣素的含量会降低，综合考虑到实验效率，确定为超声20 min。

3.4 柱温的考察

针对在含量测定中，6-姜辣素作为干姜的活性成分，但其性质不稳定。实验中考察了柱温（20，25，30，35 ℃）对色谱分离的影响，结果表明随柱温升高，供试品溶液的峰形较差，分离效果也变差，而当柱温在 25 ℃ 时，峰形较好，分离情况较好，故建议柱温控制在25 ℃。

3.5 方法学考察

结果表明，本实验方法操作简便、专属性强、重现性好，可准确测出附子理中丸中6-姜辣素的含量，因此可用于附子理中丸及其同类药品中6-姜辣素含量的控制。