清肝化瘀颗粒对原发性肝癌模型大鼠Raf/MEK/ERK通路的影响▲

边 倩 吴昭利 程丹丹 魏海梁 闫曙光 李京涛

(陕西中医药大学附属医院1 肝病二科，2 肿瘤一科，咸阳市 712000，电子邮箱：p234liuxue@163.com；3 陕西中医药大学中医临床医学院，咸阳市 712046；4 陕西中医药大学附属医院普外科，咸阳市 712000；5 陕西中医药大学基础医学院，咸阳市 712046；6 陕西中医药大学附属医院肝病一科，咸阳市 712000)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，具有难预防、预后差及死亡率高等特点。在我国，肝癌发病率在所有肿瘤中高居第4位，其已成为我国人群主要死因之一[1]。目前原位性肝癌的病因和发病机制仍未明确，临床研究表明肝癌发病是环境与饮食双重因素作用的结果，其中肝炎病毒、黄曲霉素、亚硝胺类物质、微量元素等与肝癌的发生相关[2-4]。肝癌早期症状不明显，大部分患者确诊时已处于中晚期，甚至已发生其他器官的转移，而不规范治疗会缩短患者的生存期，因此开展规范治疗对于患者的预后有重大意义。清肝化瘀颗粒药性温和，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，可以有效控制肝癌患者的病情，减轻病患的痛苦，提高患者生存质量，且临床用药副作用较小[5]。肝细胞癌变与细胞内信号通路失调相关，其中迅速加速纤维肉瘤蛋白(rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf)/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated-kinase，MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号转导通路与肝癌的发生发展密切相关[6-7]。本文探讨清肝化瘀颗粒治疗肝癌模型大鼠对Raf/MEK/ERK通路表达的影响，以进一步了解清肝化瘀颗粒治疗肝癌的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取无特定病原体级健康雄性Wistar大鼠50只，体重200～220 g，由辽宁长生生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2018-0015。整个实验过程中，大鼠均饲养于温度为20℃～25℃、湿度为55%的动物房。本研究通过动物伦理委员会批准，符合道德伦理要求。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂：二甲苯(批号：20180724)购自上海朵生生物公司，无水乙醇(批号：20171106)和过氧化氢(批号：20161020)购自南京森贝伽生物公司；一步法快速免疫印迹试验辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)试剂盒(兔)(批号:CW02029)、一步法快速免疫印迹试验HRP试剂盒 (鼠) (批号:CW02030)均购自北京康为世纪生物科技有限公司；二氨基联苯胺显色试剂(批号：20180104)购自Solarbio公司，苏木精染色液(批号：CS20170612)购自北京酷来博科技有限公司，TRIzol Reagent 总RNA提取试剂(批号：DP405-02)购自Invitrogen Fisher Scientific公司。清肝化瘀颗粒(批号：20170731)由中日友好医院药学部制剂室制备。

1.2.2 主要仪器：电泳仪(型号：DYY-6D)购自北京六一仪器厂，图像分析软件购自Adobe公司，实时荧光定量PCR仪(型号:ABI 7500型)购自美国ABI公司，低温高速离心机(型号：Centrifuge 5810R)购自上海高致精密仪器有限公司，紫外分光光度计(型号NanoDrop 2000)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及肝癌模型建立[8]：实验大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、清肝化瘀颗粒低剂量组、清肝化瘀颗粒中剂量组和清肝化瘀颗粒高剂量组，每组10只。模型对照组和清肝化瘀颗粒各剂量组大鼠给予含2.5 g/L二乙基亚硝胺的灭菌食用水自由饮用，空白对照组大鼠给予灭菌食用水自由饮用，14周后停用，清肝化瘀颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠每天分别给予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg的清肝化瘀颗粒灌胃，空白对照组、模型对照组给予等量的生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃2周。

1.3.2 肝组织形态学观察：灌胃结束时，处死大鼠，取出各组大鼠肝脏组织5 g置于10%中性福尔马林液中固定，石蜡包埋、切片后，部分用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，观察肝组织形态学变化。

1.3.3 免疫组化检测：取各组大鼠肝组织标本切片脱蜡后用抗原修复，在过氧化氢中孵育10～15 min，再用山羊血清封闭，加入一抗(武汉戴安生物，批号：20170816)4℃孵育过夜后37℃复温45 min，加入二抗(武汉戴安生物，批号：20181108)37℃孵育 30 min，加入二氨基联苯胺显色剂覆盖组织，苏木精复染1 min，脱水、透明、封片。使用IIP6.0软件测定整体A值。

1.3.4 实时荧光定量PCR：处死大鼠后，取3 g大鼠肝组织剪碎匀浆后，利用TRIzol 法提取大鼠肝组织总RNA，紫外分光光度仪检测RNA纯度。使用反转录试剂盒(上海博湖生物科技有限公司，批号：CW03028)将总RNA反转录成cDNA。以β-肌动蛋白为内参照标准进行实时荧光定量PCR，反应体系为20 μL，包括10×SYBR Green PCR溶液10 μL，引物(5 pmol/L)1 μL，模板1 μL，灭菌双蒸水8 μL。反应条件为50℃孵育2 min，然后95℃ 2 min；40个循环，95℃，15 s；60℃，1 min。采用 2-ΔΔCt法计算Raf mRNA、MEK mRNA和ERK mRNA 相对表达量。

1.3.5 免疫印迹试验检测：处死大鼠后，取3 g大鼠肝组织剪碎匀浆后，加入适量RIPA裂解液裂解组织提取总蛋白，利用二喹啉甲酸试剂盒(上海佰晔生物科技中心，批号：N1683-2)检测蛋白浓度。将所得蛋白煮沸10 min使其变性后上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳2 h，湿法转膜45 min。加入5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜后，加入一抗溶液孵育，4℃过夜，TBST洗膜后，二抗溶液室温孵育2 h。在凝胶成像系统中进行曝光，使用Image J软件检测条带灰度值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肝脏组织形态学观察 镜下可见空白对照组(图1A)大鼠肝组织结构正常，肝细胞索排列整齐，细胞膜完整，胞核清晰。与空白对照组比较，模型对照组(图1B)可见肿瘤细胞，细胞密度较大，肝细胞索排列紊乱，核质比大，核染色深，伴炎性细胞浸润等病理特征，提示肝癌大鼠模型建模成功。

空白对照组 模型对照组

图1 大鼠肝脏组织形态(HE染色，×200)

2.2 5组大鼠Raf、MEK和ERK的A值比较 与B组比较，其他4组大鼠肝脏组织Raf、MEK和ERK的A值升高；M组和H组低于C组，且M组低于H组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肝组织中Raf、MEK和ERK的A值比较(x±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05。

2.3 5组大鼠肝脏组织Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表达水平比较 与空白对照组比较，其余4组大鼠肝脏组织Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表达水平升高，清肝化瘀颗粒中剂量组和清肝化瘀颗粒高剂量组低于模型对照组，且清肝化瘀颗粒中剂量组低于清肝化瘀颗粒高剂量组(均P<0.05)。见表2及图2。

图2 各组大鼠肝脏组织Raf、MEK和ERK蛋白表达水平

表2 5组大鼠Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05。

3 讨 论

近年来，中国肝癌的发病率和病死率具有逐年上升趋势[1]，给社会发展和公共健康带来极大的负担。肝癌的治疗主要以手术、放疗和化疗为主，虽然取得一定成果，但患者预后仍较差，生存率仍未欠满意。有研究证实，Raf/MEK/ERK信号通路与肿瘤发生发展密切相关，该通路活化异常可导致肿瘤发生。例如Zhou等[9]发现，抑制Raf/MEK/ERK信号通路的活化可诱导人骨肉瘤细胞凋亡，阻滞G2/M细胞周期生长，并抑制细胞迁移及侵袭；Zhang等[10]认为下调Raf/MEK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路表达，可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖；Zhu等[11]发现肝癌细胞的增殖、分化、转移等与Raf/MEK/ERK信号转导通路密切相关。Raf、MEK和ERK都是人体内常见的蛋白激酶，其中Raf被激活后其C端催化区与MEK结合激活MEK，而活化的MEK通过N端区域与ERK直接连接进一步激活ERK。三者在Raf/MEK/ERK通路中发挥重要的作用，测定Raf、MEK和ERK蛋白表达水平可反映出Raf/MEK/ERK通路活化情况。

清肝化瘀颗粒主要成分包括苦参、黄芪、白术、白花蛇舌草、義术、三棱、半枝莲、甘草等。苦参主要药用成分为苦参素，研究显示苦参素抑制肝内炎症反应和肝内纤维组织增生，具有免疫调控、抗炎和抗纤维化功能[12]。黄芪多糖与枸杞多糖联用对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用[13]。白术通过抑制核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路的活化，从而改善大鼠肝脏脂肪代谢紊乱，减轻肝脏脂质蓄积[14]。甘草总黄酮具有抗硫代乙酰胺诱导大鼠慢性肝纤维化的作用[15]。白花蛇舌草提取物通过抑制相关炎症因子的表达，调节固有免疫系统的平衡而起到改善肝损伤的作用[16]。以上研究表明，清肝化瘀颗粒具有肝组织保护的药效。

本研究采用饮用含二乙基亚硝胺的灭菌水建立肝癌大鼠模型，组织病理学提示成功建立肝癌大鼠模型。本研究结果显示，肝癌大鼠肝脏组织Raf、MEK和ERK mRNA及蛋白表达水平升高，给予中、高剂量的清肝化瘀颗粒干预后，上述mRNA及蛋白表达水平均降低，且中剂量效果更为明显，提示一定剂量的清肝化瘀颗粒对Raf/MEK/ERK通路具有抑制作用。清肝化瘀颗粒是由不同成分的中药组成，其抑制Raf/MEK/ERK通路的活性成分仍不明确，需要进一步进行其他成分实验研究或Meta分析才可验证其作用机制。

综上所述，清肝化瘀颗粒可通过抑制Raf/MEK/ERK信号通路，这或是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。