肝内胆管细胞癌患者IDH1基因状态与组织学特征的关系

闫春伟，田立蕊，李 扬，李艳静，常鸿艳

1.秦皇岛市第三医院病理科，河北 秦皇岛 066000； 2.秦皇岛市中医医院胃肠镜室

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是仅次于肝细胞癌的肝脏恶性肿瘤，占肝脏原发肿瘤的10%～15%[1]。研究表明，ICC中的异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)新生突变与肝内起源高度相关[2-3]。IDH1是三羧酸循环中能催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成酮戊二酸的一种酶类[4-7]。IDH1突变多发生在R132位点。近年该突变在胆管癌中的干扰表型或功能分化影响也受到了广泛关注[8-9]。

鉴于IDH1突变肿瘤的单一代谢紊乱，似乎可以考虑该分子亚型是否能产生可识别的表型。ICC根据大体形态可分为团块型、管周浸润型和管内亚型3种。而组织学亚型的临床意义较少得到证实，因此被广泛接受的也不多。肿瘤可分为“外周”和“肺门”两种亚型，另外，根据其相似性可分为大胆管细胞(大管型)和小胆管细胞(小管型)[10-11]，其他类型如胆管板畸形也有描述[12]。目前来看，虽然IDH1突变的预后相关性尚不确定，但有望成为白血病、胶质瘤、胆管癌及其他临床试验中潜在的小分子治疗靶点[13-15]。本研究通过探究ICC中IDH1突变的基因状态和组织学特征，这将有助于临床识别IDH1突变肿瘤。

1 材料与方法

1.1 研究设计采用MSK-IMPACT测序平台检测ICC中IDH1外显子4(41～138)和IDH2外显子4(125～178)的突变[16]，按IDH1突变情况进行分级，并排除IDH2突变肿瘤，其中野生型IDH(wtIDH)定义为MSK-IMPACT测序结果显示IDH1和IDH2并无变化，频率改变经信号通路分组后并采用Reactome开源路径数据库分析。本研究经相关医学伦理学会审批并同意。

1.2 临床和病例变量通过回顾电子病例的方式收集如年龄、性别、自身免疫性疾病史、慢性病毒性肝炎、吸烟、肝硬化等临床基础资料，并以回顾病理切片和报告的方式评估肿瘤大小、分级、是否存在神经周浸润、淋巴血管浸润、管周浸润、卫星结节、黏液、管内前体病变等。采用以往的方法如原位杂交检测白蛋白mRNA表达及精氨酸酶-1和HepPar-1免疫组化结果进行小管型与大管型的比较[17]。肿瘤分级采用乳腺癌常用Bloom-Richardson分级法、临床分期及淋巴结状态评分采用美国癌症联合会AJCC第8版的切除时可用的病理和临床信息。

肿瘤类型可分为四种模式。吻合结构由吻合小管结构如胆管反应组成，单管状结构由腺体间间质不吻合的小管组成，密集管状结构有腔或裂隙样间隙，但腺体聚集在一起无间质，团块结构则由最少的腔融合。通过回顾所有的幻灯片，结构异质被认为无≥75%显性结构的肿瘤。采用半定量肿瘤体积评估法测定坏死和纤维化的百分率。纤维化形态被定义为不介入活肿瘤腺体的纤维化离散区域。细胞形态被分为低立方形、饱满立方形/多边形和柱状，其中低立方形的根尖细胞质长度<1个核直径，饱满立方形/多边形的根尖细胞质长度为1～2个核直径或>细胞核的2倍宽，柱状细胞的根尖细胞质(含有或不含有黏蛋白)长度>2个核直径。透明细胞特征为能看见>10%的肿瘤细胞。

1.3 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用Fisher’s精确检验进行分类变量的统计学比较。对组织学比较，排除接受新辅助治疗的肿瘤，仅小管型肿瘤被纳入分析。比较分析所有肿瘤的临床及组织学特征的IDH1突变体间的关系，并对小管肿瘤进行重复分析。复发的肿瘤切片纳入IDH1形态学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICC患者小管型IDH1临床资料比较其中IDH1外显子4的体细胞性改变分别由p.R132C(46例，79.3%)、p.R132L(6例，10.3%)和p.R132G(6例，10.3%)组成。研究中所有mIDH1均为小管型，而大管型(n=18)和不确定(n=6)只存在于wtIDH1组中，因此排除这24例并不作为临床病理分析。自身免疫性疾病mIDH1较wtIDH1患病率更高，差异有统计学意义(P<0.001)(见表1)，wtIDH1组6例患者分别患有桥本甲状腺炎(2例，1.4%)、类风湿关节炎(2例，1.4%)、硬皮病(1例，0.6%)和克罗恩氏结肠炎(1例，0.6%)等自身免疫疾病。

2.2 ICC患者小管型IDH1组织学特征比较ICC中IDH1突变体的各种标本结构和细胞形状如图1所示，其中wtIDH1饱满立方形/多边形、纤维化结构、区域型纤维化、低立方形与mIDH1有显著相关性(P均<0.001)，而低立方形则与wtIDH1显著相关(P<0.001)，分析中还显示IDH1突变与标本结构无关(见表2)，IDH1突变体组织学如图2所示。密集管状结构在两组中是优势形态，但两组形态体积几乎相似(见表2)。通过内外黏蛋白的鉴定并不能完全区分mIDH1和wtIDH1，但明显存在于两组中(见图2H～2I)。另外通过原位杂交染色白蛋白mRNA显示组间并无差异，在58例mIDH1检测中，38例(65.5%)显示白蛋白阳性，而145例wtIDH1中，120例(82.8%)显示白蛋白阳性(P=0.084)。而肝细胞分化标志物的免疫组化结果显示，mIDH1中无精氨酸酶-1阳性，wtIDH1中2例(1.4%)精氨酸酶-1阳性；mIDH1中无HepPar1阳性，wtIDH中2例(1.4%)HepPar1阳性。具体数据未显示。

表1 ICC小管型mIDH1与wtIDH1临床特性比较Tab 1 Comparison of clinical characteristics of ICC tubules mIDH1 and wtIDH1

图1 ICC中IDH1突变体的各种标本结构和细胞形状 A：管状型；B：吻合型；C：团状型；D：低立方形；E～G：饱满立方形/多边形细胞；H：清晰细胞特征；I：区域型纤维化Fig 1 Various specimen structures and cell morphology of IDH1 mutant in ICC A: tubular; B: anastomosing; C: solid； D: low cuboidal; E-G: plump cuboidal/polygonal cells; H: clear cell characteristics; I: regional fibrosis

图2 IDH1突变体中的不同组织学和细胞形状 A：具有饱满立方形细胞的吻合腺体；B：微乳头状；C：膨胀管状的低立方形细胞；D：团状型中多边形细胞的多形核；E：团状型；F：管状和饱满立方形的吻合腺体；G：吻合腺体的饱满立方形；H～I：管状立方形细胞和黏蛋白胭脂红染色突出地聚集在细胞内外的黏蛋白

Fig 2 Different histology and cell shapes in the IDH1 mutants A: anastomotic glands with plump cuboidal; B: micro papillary; C: dilated tubular low cuboidal; D: polymorphonuclear of polygonal cells in the cluster; E: solid; F: tubular and full cubic anastomotic glands; G: plump cuboidal of anastomosing aden; H-I: tubular cuboidal cells and mucin carmine staining highlight the aggregation of mucin inside and outside the cells

表2 ICC小管类型mIDH1与wtIDH1组织学特性比较Tab 2 Comparison of histological characteristics of ICC tubule types mIDH1 and wtIDH1

注：a为新辅助化疗治疗肿瘤被排除。

2.3 ICC患者小管型IDH1基因状态及通路比较研究显示，wtIDH1中FGFR2和KRAS基因重排相比mIDH1组，差异有统计学意义(P=0.001；P=0.014)，而其他则无统计学意义，另外wtIDH1组中MAPK信号通路相比mIDH1组更低，差异有统计学意义(P<0.001)(见表3)。

表3 ICC小管状mIDH1和wtIDH1的突变和基因通路 [n(%)]Tab 3 Mutations and gene pathways of ICC tubular mIDH1 and wtIDH1 [n(%)]

注：a：AR1D1A、PBRM1、ATRX；b：BAP1、TP53、ATM、BRCA1、BARD1、KMT2A、KMT2C；c：KRAS、FGFR2、NF1、ARAF、BRAF、RASA1、MAP2K1、MAPK3、PDGFRA、GRIN2A；d：PTEN、PIK3R2、RPTOR。

3 讨论

众所周知，ICC的IDH1突变能独特的改变细胞生物学特性，特别是在分子水平上影响细胞分化。我们通过先前靶向测序分析ICC表型并进行了系统的分类，进一步的比较分析了组织结构形态，这有望识别突变相关的特征表型。研究中观察到所有mIDH1 ICC均为小管型。通过比较mIDH1组和wtIDH，mIDH1肿瘤细胞比例明显较高，mIDH1相比非突变ICC具有更多的透明细胞改变，并且细胞分化的比例也较低。本研究相比其他方法和研究，增加了小管组织学研究，然而，目前还没有ICC分化分级基础标准，因此，本研究采用了从有丝分裂活动和结构的乳腺癌分级系统进行分级。

由于大多数肿瘤分化标准的组织结构复杂性，因此本研究的另一个目的是分析mIDH1是否与细胞分化改变相关，且与组织结构是否存在明显相关性。肝内胆管细胞癌由于其独特的结构模式，受到广大学者的关注，特别是就其结构模式进行细分具有潜在的临床或生物学意义[18]。有研究表明，胆管板畸形结构与ARID1A突变有关[19]。本研究显示mIDH1和wtIDH1、ICCs均为异质结构，且在显性结构模式上非常相似，本研究发现饱满立方形/多边形细胞形态学上类似于癌细胞和肝细胞癌的代谢和基因表达改变。IDH1突变体会积累代谢物(R)-2-羟基戊二酸盐，使得线粒体基因表达量升高，癌细胞通常具有饱满/多边形形状[4]。研究也表明，突变IDH会阻断肝细胞分化和ICC中IDH突变表达肝祖细胞基因信号[20]。

本研究中评估的临床变量中，只有自身免疫性疾病与IDH1突变状态具有显著的相关性，但mIDH1患者并无患有自身免疫性疾病的病例，这直接与胆道疾病如原发性硬化性胆管炎有关，当然这也与胆管癌区域性危险因素及分子亚型如肝吸虫感染等临床因素有关。这项ICC研究涉及的人群缺乏肝吸虫感染、肝结石、胆道囊肿和慢性肝炎患病率较低等。因此，这些潜在的混淆因素可能增加wtIDH1组的生物异质性。本研究在分析时删除了大管型和不确定型，它们在形态上与小管类型显著不同，这在一定程度上减少了wtIDH组内的生物结构异质性。

总之，我们的研究结果表明，mIDH1肝内胆管细胞癌是小管型，并且相比wtIDH1组在细胞形状(饱满立方形/多边形)和纤维化结构等方面具有显著性差异。通过对ICC患者的IDH1基因状态和组织学特征进行系统性描述分类，这将有助于临床上有效识别肿瘤表型，这IDH1靶向治疗研究提供了重要的指导意义。