锌对嗜酸乳杆菌生长及菌体内元素含量影响研究

赵倩倩，闫赖赖,2，解 清,2，刘雅琼,2，杨思宇，郭 辰，王京宇, 2*

1. 北京大学公共卫生学院卫生检验学系，北京 100191 2. 北京大学医药卫生分析中心生命元素组学实验室，北京 100191

引 言

嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中极受重视的益生菌之一，被视为第三代酸乳发酵剂菌种[1-2]。嗜酸乳杆菌是胃和人体小肠内的主要益生菌，释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，抑制肠道不良微生物的增殖，调节肠道菌群平衡，具有营养、抗癌、增强机体免疫力与抗衰老等作用[3]。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌科中的乳杆菌属，为革兰氏阳性杆菌，形态呈细长杆状，最适生长温度为35～38 ℃，20 ℃以下不生长，耐热性差[4]。最适pH为5.5～6.0，耐酸性强，能在其他乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖[5]。能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵。

锌(Zn)元素是人体生命代谢中非常重要的微量元素，是碱性磷酸酶、乙醇脱氢酶、氨基肽酶等多种生物酶类的重要辅基，参与糖类、脂类、蛋白质的合成和降解等重要的新陈代谢过程，还可调节细胞的增殖、分化、程序性凋亡[6]，Zn在人体生命活动中发挥着至关重要的作用。然而Zn过量对细胞有毒害作用，主要是竞争性地与其他功能金属离子的蛋白结合位点结合，使其失活并形成羟基自由基，对DNA、蛋白质和脂类造成伤害[7]； 此外，高浓度Zn还会抑制电子传递链中的电子传递，从而影响呼吸作用，进而对生物体造成损伤[8]。

国内对嗜酸乳杆菌单一菌种的研究还相对较少[9]，对微量元素与嗜酸乳杆菌之间的关系研究更是罕见。此外，现有相关研究还存在着元素刺激浓度不一致、涉及元素有限、实验分组过少、缺乏重复实验等不足。本研究以Zn为研究起点，设立多个实验组，观测培养液中不同浓度Zn对嗜酸乳杆菌生长速度的作用，并使用ICP-MS测定45种元素，以期得出更加全面的分析结果，从多元素层面探讨对嗜酸乳杆菌生长产生作用的元素组及其可能的机制。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要设备

电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)： 美国Perkin Elmer Sciex公司，ELAN DRC Ⅱ； 分光光度仪： HITACHI公司，U-3010。

1.1.2 主要试剂

(1)单元素标准溶液

Zn，Se和B等，浓度： 1 000 ng·mL-1，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心。

(2)内标溶液

Rh(1 000 ng·mL-1)，In(1 000 ng·mL-1)，Re(1 000 ng·mL-1)，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心。

(3)标准物质

猪肝(GBW10051)； 人发成分分析标准物质(GBW09101a)； 人发成分分析标准物质(GBW09101b)； 生物成分分析标准物质。

(4)细菌菌种

嗜酸乳杆菌： CGMCC编号1.1878，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 方法

(1)实验设计与分组

实验包括1个对照组及6个实验组，每组6个平行样。培养液中Zn浓度分别为0，200，400，600，800，1 000和1 200 ng·mL-1，用超纯水定容至40 mL。配制完成后高温灭菌备用。

(2)嗜酸乳杆菌培养及其吸光度值测定

活化扩增嗜酸乳杆菌菌种，用分光光度仪于600 nm测量其吸光度(OD值)。待OD值稳定在1±0.05时，取等量(100 μL)活化菌液接种于不同Zn浓度的MRS培养基，置于37 ℃恒温摇床(100 r·min-1)培养。每2 h将各管培养液摇匀，定量吸取2 mL培养液于离心管中，再次摇匀后，取0.6 mL测定OD值，测定时使用的空白液与待测液的Zn浓度保持一致； 剩余1.4 mL经离心后弃去上清液； 在沉淀中加入1.4 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液轻摇洗涤，离心后弃上清液，再度重复上述步骤后，于沉淀物中加入100 μL浓硝酸，室温下消化12 h； 消化液于-4 ℃冰箱保存，待测。

(3)仪器条件优化及元素测定

经优化，分光光度仪、离心机、ICP-MS仪器参数分别列于表1—表3。

用标准物质进行质量控制，确保样品前处理及检测过程的可靠性与准确性； 在测量时加入内标，以校正仪器的信号漂移。对于元素含量超出标准曲线上限的样品，稀释一定倍数后重新上机测定。

表1 分光光度计仪器参数Table 1 Spectrophotometer instrument parameters

表2 离心机仪器参数Table 2 Centrifuge instrument parameters

表3 ICP-MS仪器参数Table 3 Instrument parameters of ICP-MS

将冷消化后的细菌样品从冰箱取出后，室温下解冻，在每个待测样品(0.1 mL)中准确加入0.1 mL混合内标(Rh： 20 ng·mL-1，In： 2 ng·mL-1，Re： 2 ng·mL-1)和1.8 mL超纯水，充分混匀后离心，测定上清液中无机元素含量。

1.3 数据分析

采用重复测量资料分析方法比较各组间OD值及元素含量的差异，元素含量与OD值之间的相关性采用Spearman分析； 各元素含量间的相关性采用偏相关分析。以上统计方法，均设定双侧p<0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 Zn浓度对嗜酸乳杆菌生长速度的影响

每隔2 h测定一次嗜酸乳杆菌菌液OD值，获取嗜酸乳杆菌生长曲线。如图1和图2所示，随着培养液Zn浓度上升，嗜酸乳杆菌生长刺激反应幅度逐渐增强，并在Zn浓度为600 ng·mL-1时达到最大值； 随着Zn浓度继续增加，嗜酸乳杆菌生长的刺激反应幅度逐渐减弱； 当Zn浓度上升到1 000 ng·mL-1时，Zn对嗜酸乳杆菌的生长已出现抑制效应。这与稀土元素的Hormesis效应相似，即低剂量促进高剂量抑制的效应[10]。Zn的刺激作用可能与氧化还原酶、水解酶、转移酶、裂合酶、连接酶、异构酶等含锌金属酶的作用有关，非致病性异养菌中锌金属蛋白酶的主要功能是水解环境中蛋白或多肽，以获得氨基酸作为养料。细菌还有高亲和力的Zn2+转运系统，用以获取足够的Zn2+ [11]。

既往关于Zn毒性研究多集中在对动物机体各方面的毒性作用，给动物补充过量的Zn时，会出现中毒症状，对消化系统、骨骼系统、生殖和免疫系统产生毒性作用[12]。过量的Zn不仅对动物机体产生不良影响，对细菌也具有毒性作用，细菌通过一些特有的机制来解除重金属离子对它们的毒害，主要包括外排机制，螯合机制和外排后结合机制[13]。上述机制或许能够部分解释Zn过量后对于嗜酸乳杆菌生长的抑制作用。

本研究显示，嗜酸乳杆菌在含Zn培养液中的生长曲线呈倒U字型(图2)，在Zn浓度为600 ng·mL-1时到达顶点，这一结果对在嗜酸乳杆菌培养液中添加微量元素以控制其生长速度具有参考价值。

通过比较600 ng·mL-1Zn浓度组与对照组在各个时间点的OD值，获得了本实验中Zn对嗜酸乳杆菌生长的最大刺激反应幅度(见表4)。计算公式为(ODmax-OD对照)/OD对照。

图1 嗜酸乳杆菌部分实验组生长曲线图Fig.1 Lactobacillus acidophilus growth curve of partial group

2.2 嗜酸乳杆菌生长速度与菌体内元素含量的相关性

实验测定了45种元素的含量，去除15种未达到检出限的元素，得到30种元素的定量数据(表5)。对单位OD值下嗜酸乳杆菌菌体各元素含量与OD值进行Spearman非参数相关分析。结果显示，Zn，Rb，Ti和Ag在所设计的5个时间点均有统计学意义，Se，Sr和Sb在4个时间点有统计学意义，Al，Mn，Fe，Co，Cd和Ba在3个时间点有统计学意义； 2～10 h整体分析结果中，除La以外，其他元素的含量值与OD值的相关系数均具有统计学意义。由表5初次观察到，Se，Fe，Mn，Co，Zn和Sr等有益元素含量值与OD值之间呈正相关，而U，Al，Ti，Sb和Pb等有害元素则为负相关。上述结果首次将嗜酸乳杆菌生长速度与菌体内有益元素和有害元素含量联系在一起，并由此或许可以得出导致嗜酸乳杆菌生长速度提升的潜在机制假设： 适当量的Zn干预可以刺激杆菌吸收有益元素，阻碍有害元素的吸收，进而加速嗜酸乳杆菌生长。上述假设需要进一步实验加以验证。

图2 嗜酸乳杆菌各实验组生长曲线Fig.2 Growth curve of all groups of Lactobacillus acidophilus

表4 锌对嗜酸乳杆菌的最大刺激反应幅度Table 4 The maximum stimulation response ofzinc to Lactobacillus acidophilus

在控制OD值的条件下，各时间点嗜酸乳杆菌中各元素含量与Zn含量之间的相关性偏相关分析结果如表6所示： Cu，Rb，Mn，Se，Sr和U在4个时间点有统计学意义，Fe，Co，Cd在3个时间点有统计学意义； Cu，Cd，Mo和U的在部分时间点呈负相关，其余时间点及其他元素均为正相关； Zn与Se含量之间相关系数为0.726，Zn与其他元素相关系数介于0.4～0.6之间。

表5 元素含量与OD值相关分析结果Table 5 Analysis of correlation between element content and OD value

续表5

La0.2340.455∗∗0.403∗∗0.0950.092-0.016Ce-0.338∗-0.398∗∗-0.399∗∗-0.1010.278-0.356∗∗Pr-0.184-0.136-0.264-0.207-0.087-0.406∗∗Nd-0.186-0.27-0.2720.192-0.02-0.466∗∗Sm-0.133-0.125-0.2540.166-0.13-0.408∗∗Eu-0.168-0.213-0.309∗0.193-0.116-0.130∗Gd-0.263-0.308∗-0.322∗-0.0100.088-0.466∗∗Li-0.421∗∗-0.1590.130-0.033-0.065-0.338∗∗B0.181-0.245-0.113-0.278-0.317∗-0.200∗∗Al-0.251-0.466∗∗-0.494∗∗-0.288-0.506∗∗-0.557∗∗Ti-0.556∗∗-0.449∗∗-0.472∗∗-0.387∗∗-0.579∗∗-0.552∗∗Cr0.1990.136-0.245-0.1000.138-0.278∗∗Mn0.1600.374∗0.409∗∗0.2570.301∗0.512∗∗Fe0.2650.397∗∗0.311∗0.1880.332∗∗0.569∗∗Co0.0720.321∗0.513∗∗0.1160.391∗∗0.439∗∗Ni0.186-0.321∗-0.464∗∗-0.078-0.276-0.404∗∗Ge0.084-0.267-0.251-0.058-0.151-0.439∗∗Se0.2680.468∗∗0.599∗∗0.304∗0.342∗0.656∗∗Sr-0.313∗-0.371∗∗-0.476∗∗-0.224-0.641∗∗-0.307∗∗Mo0.1290.026-0.335∗-0.0230.184-0.321∗∗Ag-0.455∗∗-0.715∗∗-0.791∗∗-0.538∗∗-0.449∗∗-0.593∗∗Cd-0.595∗∗-0.443∗∗-0.164-0.228-0.394∗∗-0.364∗∗Sb-0.531∗∗-0.352∗-0.456∗∗-0.516∗∗-0.240-0.540∗∗Ba-0.361∗-0.502∗∗-0.302∗-0.184-0.180-0.540∗∗Th-0.1350.029-0.214-0.0490.032-0.303∗∗U-0.714∗∗-0.475∗∗-0.544∗∗-0.294-0.677∗∗-0.585∗∗

注： **表示在置信度(双侧)为0.01时，达到显著的相关； *表示在置信度(双侧)为0.05 时，达到相关； “-”表示负相关。

表6 菌体内Zn与其他元素含量相关分析结果Table 6 Elemental content-Zn content correlation analysis results

续表6

Cd-0.010-0.398∗-0.617∗∗-0.314-0.558∗∗-0.594∗∗Sb-0.0130.640∗∗0.2720.446∗∗0.1620.398∗Ba0.0260.526∗∗0.3300.484∗∗0.2540.311Th-0.2470.0510.1010.103-0.036-0.035U-0.080-0.593∗∗-0.587∗∗-0.524∗∗-0.652∗∗-0.426∗∗

注： **表示在置信度(双侧)为0.01时，达到显著的相关； *表示在置信度(双侧)为0.05时，达到相关； “-”表示负相关。

3 结 论

根据实验结果得出如下主要结论： (1)培养液中Zn的浓度变化会对嗜酸乳杆菌生长产生刺激效应，并在Zn浓度为600 ng·mL-1时达到最大值。(2)培养液中添加Zn可以调节嗜酸乳杆菌菌体内有益与有害元素的吸收，菌体内无机元素的再平衡或许是Zn干预提升嗜酸乳杆菌生长速度的潜在机制。