Lager酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建

李梦琦，张可心，郑飞云，钮成拓，刘春凤，李 崎，王金晶＊

（1.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学酿酒科学与工程研究室，江苏 无锡 214122）

基因功能研究常用策略为基因编辑技术，即基因敲除、敲减或过表达、敲入。基因水平研究表型是基因功能研究常用方法，成簇规律间隔性短回文序列（Cluster regularly interspaced short palindrome repeats，CRISPR）技术因操作简便、快速、高效，无种属限制，成为基因功能研究热点和常用工具。

CRISPR-Cas 系统是细菌和古细菌在长期演化过程中获得的适应性免疫系统[1]。主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，Ⅰ和Ⅲ型需多种Cas蛋白共同协助，而CRISPR-CasⅡ（CRISPR-Cas9）仅需单一Cas9 蛋白，在真核生物和原核生物中直接作RNA 引导基因组编辑系统[2-3]，CRISPR-Cas9 系统应用更广泛。CRISPR-Cas 技术已应用于植物[4-5]、哺乳动物[6-7]。在微生物中，传统方法难以遗传操作细菌染色体中，CRISPR-Cas技术被成功应用[8-9]，在酵母中该技术实现高效率基因编辑[10-11]。目前在真核细胞中应用CRISPR-Cas 系统主要由两部分构成，向导RNA（Single-guide RNA, sgRNA）和Cas 蛋白。sgRNA 代替CRISPR 间隔序列转录形成tracrRNA:crRNA复合物，由Cas蛋白引导并结合到目标基因靶点前间隔子相邻基序列（Protospacer adjacent motif,PAM）区域，将靶位点DNA链切割导致DNA双链断裂（Double strains break,DSB）。形成DSB 通常通过非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）和同源重组（Homology-directed repair,HDR）方式修复，将目的基因敲除。

啤酒酵母根据其酵母种类分为拉格（Lager）型和艾尔（Ale）型两大类，工业啤酒生产菌株多为lager型啤酒酵母[12]。利用这类酵母发酵啤酒口感清爽、纯净，其中典型菌株如Pilsner 菌株是皮尔森型啤酒生产菌种。Lager 型啤酒酵母（S.pasteurianus）全基因组测序结果表明该酵母为异源多倍体杂交种，其中一个亲本为酿酒酵母（S. cerevisiae），另一个亲本为真贝酵母（S. eubayanus）[13-14]。在S. cerevisiae基因编辑研究中，CRISPR-Cas 编辑系统较成熟且应用广泛[15]，另有同源重组基因编辑系统和Cre-loxP基因编辑系统等。S. eubayanus基因注释不完善，研究多用传统育种手段，S.eubayanus基因编辑系统研究较少。Lager 酵母杂倍性，传统酿酒酵母单倍体菌株多采用基因工程手段在啤酒酵母中适用性低，采用传统同源重组方法难以完全将目的基因敲除，前期基因功能研究基于部分基因调控[16]，或以S.cerevisiae为模式菌株开展研究。因此，这些方法不能对某些功能基因在啤酒酵母中作用开展深入研究。Lager酵母经长期复杂杂交过程，基因组中发生多次基因水平改变。对Lager酵母全基因组测序发现不同Lager 酵母间存在基因变异[17]，本研究针对典型Lager 型啤酒酵母Pilsner 中靶基因作CRISPRCas9 系统sgRNA 设计构建。将CRISPR-Cas9 系统应用于Lager 酵母，降低Lager 酵母基因编辑难度，为其基因功能研究提供便利。与其他基因编辑方法相比，CRISPR-Cas9系统存在于原核生物体内免疫防御系统，识别精准度高于蛋白质对于核酸序列识别，敲除过程中只要有一个碱基无法正确配对即无法切割靶序列。该系统可一次性敲除多个等位基因，提高敲除成功率。本研究在啤酒酵母S.pasteurianus中建立CRISPR-Cas9 基因编辑系统，以TRP1 基因为靶向基因，获得TRP1 缺陷菌株。该方法可一次性敲除多个等位基因，实现啤酒酵母杂倍体菌株中基因编辑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培养基

啤酒酵母Pilsner，由江南大学酿酒科学与工程研究室保藏；大肠杆菌宿主菌E.coli JM109 购自TaKaRa公司；质粒pMY 、YEp352-PAK 由本研究室保藏；质粒pRCC- K 购自addgene（由北京中原合聚经贸有限公司代理）。质粒YEp352-PAK 由质粒YEp352 改造得到，在原始质粒基础上，替换来源于S.cerevisiae基因组PGK1 启动子和ADH1 终止子[18]。质粒pMY由质粒pMD19-T 与产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中一段1.2 kb 长度5.8 SrDNA 基因片段、GAP 启动子、AOX 终止子和基因URA5整合而成[19]。

LB 培养基：蛋白胨10 g·L-1，酵母抽提物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，固体培养基添加20 g·L-1琼脂粉，121 ℃灭菌20 min。若为筛选培养基则需另添加氨苄青霉素至终浓度100 μg·mL-1或另添加卡那霉素至终浓度50 μg·mL-1。

YPD 培养基：酵母抽提物10 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，115 ℃灭菌15 min。固体培养基添加20 g·L-1琼脂粉，115 ℃灭菌15 min。筛选培养基则需添加G418 至终浓度200 μg·mL-1。

1.1.2 主要试剂

大肠杆菌感受态制备试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶、T4DNA 连接酶、DNA Maker、PrimeSTAR Max DNA Polymerase, rTaq 聚合酶购自TaKaRa公司；Phanta Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Cycle Pure Kit PCR 纯化试剂盒购自美国Omega Bio-Tek 公司；HieffCloneTM Plus One Step Cloning Kit Cat No.10911 试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；引物合成，基因测序由金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.3 引物列表

结果见表1。

表1 引物列表Table 1 Primer list

1.2 方法

1.2.1 质粒pMY-PGK1构建

以质粒YEp352-PAK为模板，利用表1中引物cut-PGK1-F 和cut-PGK1-R 扩增启动子PGK1。以质粒pMY 为模板，利用表1 中引物cut-GAP-F 和cut-GAP-R，PCR 扩增质粒pMY 部分片段作为载体。片段纯化后，使用One Step Cloning 试剂盒连接载体和片段。克隆过程如图1所示。重组质粒转入JM109 感受态细胞，挑取单克隆于筛选培养基中培养过夜，使用质粒提取试剂盒提取重组质粒pMY-PGK1，利用引物cut-gRNA-F 和cut-gRNAR作PCR扩增并测序验证。

1.2.2 sgRNA 寡核苷酸双链序列设计

分别对S. cerevisiae基因组中TRP1 基因（NC_001136.10）和S. eubayanus基因组中TRP1基因（NC_030979.1）作sgRNA 靶点选择及序列设计（https://chopchop.cbu.uib.no/），基因序列参考NCBI 中S.cerevisiaeS288C 和S.eubayanus基因组中TRP1 基因序列。由此得到TRP1-SC-sgRNA 和TRP1-SEsgRNA两种寡核苷酸双链，具体序列见表2。

图1 质粒pMY-PGK1构建过程Fig.1 Plasmid pMY-PGK1 construction

表2 S.cerevisiae 和S.eubayanusTRP1基因sgRNATable 2 sgRNA for TRP1 gene of S.cerevisiae and S.eubayanus

1.2.3 质粒pMY-TRP1-SC，pMY-TRP1-SE，pMYPGK1-TRP1-SC和pMY-PGK1-TRP1-SE构建

设计引物SC1-20D-F 和SC1-20D-R，SE1-20D-F 和SE1-20D-R（见表1），引物中包含TRP1基因sgRNA，以质粒pMY 和pMY-PGK1 为模板PCR 扩增该质粒中部分片段，分别在E.coli JM109中表达，分别挑取单克隆，提取已修改sgRNA 序列（分别为TRP1-SC-sgRNA 和TRP1-SE-sgRNA）质粒pMY 和pMY-PGK1 并验证。由于质粒pMY 和pMY-PGK1 中锤头状核酶（Hammerhead ribozyme，HH）结构5'端前6 个核苷酸序列与sgRNA 中5'端前6个核苷酸序列呈回文结构，因此同样方法修改质粒pMY和pMY-PGK1中HH核酶结构中5'端前6个核苷酸序列，引物均为SC1-6D-F 和SC1-20D-R，SE1-6D-F 和SE1-6D-R 见表1。由此构建质粒pMY- TRP1-SC，pMY- TRP1-SE，pMY-PGK1-TRP1-SC和pMY-PGK1-TRP1-SE。

1.2.4 质 粒pMY- Cas9- TRP1- SC， pMY- Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE构建

分别以质粒pMY-TRP1-SC，pMY-TRP1-SE，pMY-PGK1-TRP1-SC 和pMY-PGK1-TRP1-SE 为模板，均以G-PGK1-pMY-F 和G-PGK1-pMY-R 为引物，扩增pMY-TRP1-SC，pMYTRP1-SE，pMY-PGK1-TRP1-SC 和pMY-PGK1-TRP1-SE 部分片段。以质粒pRCC-K 为模板，GCas9-F和G-Cas9-R为引物，扩增pRCC-K部分片段为载体。片段纯化后，使用One Step Cloning 试剂盒分别连接。pMY-Cas9-TRP1-SC 和pMYCas9-TRP1-SE 构建过程如图2A 所示，pMYPGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 构建过程如图2B 所示。重组质粒分别转入E.coli JM109 感受态细胞，挑取转化子，提取质粒并对重组质粒作测序验证。

图2 质粒pMY-Cas9-TRP1-SC，pMY-Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE构建过程Fig.2 Construction process of plasmids pMY-Cas9-TRP1-SC,pMY-Cas9-TRP1-SE,pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC and pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE

1.2.5 TRP1敲除菌株构建

以表1中引物TRP1-SC-TONG-F和TRP1-SCTONG-R，TRP1-SE-TONG-F 和TRP1-SE-TONGR 互为模板，PCR 扩增长度为100 bp TRP1 修复DNA TRP1-SC 和TRP1-SE，将质粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE、修复DNA TRP1-SC 和TRP1-SE 电转化入啤酒酵母Pilsner 感受态细胞。再以同样方法，将质粒pMYCas9-TRP1-SC、pMY-Cas9-TRP1-SE、修复DNA TRP1-SC 和TRP1-SE 电转化入啤酒酵母Pilsner 感受态细胞。断裂DNA 双链作同源重组修复。28 ℃培养2 d，分别挑取转化子，均以TRP1-SC-F 和TRP1-SC-R、TRP1-SE-F 和TRP1-SE-R 为引物，作菌落PCR验证基因TRP1敲除。

2 结果与分析

2.1 质粒pMY-Cas9-TRP1-SC，pMY-Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC和pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE构建

pMY 和YEp352-PAK 质 粒，PCR 扩增 相 应片段后利用无缝克隆技术连接，重组质粒命名为pMY-PGK1。PCR 扩增质粒pMY-PGK1 中gRNA 和PGK1启动子片段并测序验证。

质粒pMY 和pMY-PGK1 均两次PCR 扩增，点突变修改质粒中sgRNA序列和质粒中HH核酶结构5'端前6 个核苷酸与sgRNA 回文序列。测序验证，结果表明质粒pMY-TRP1-SC、pMY-TRP1-SE、pMY-PGK1-TRP1-SC 和pMY-PGK1-TRP1-SE 构建成功。

扩增质粒pRCC-K 相应片段，质粒pMYTRP1-SC、pMY-TRP1-SE、pMY-PGK1-TRP1-SC和pMY-PGK1-TRP1-SE PCR扩增相应片段，利用无缝克隆技术连接成质粒pMY-Cas9-TRP1-SC，pMY-Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE。

2.2 pMY-Cas9-TRP1-SC和pMY-Cas9-TRP1-SE未能成功敲除基因TRP1

将构建成功质粒pMY-Cas9-TRP1-SC、pMYCas9-TRP1-SE 和目的基因TRP1 修复DNA TRP1-SC、DNA TRP1-SE 电转化入啤酒酵母Pilsner 感受态细胞，电转化入啤酒酵母Pilsner 感受态细胞，分别挑取单克隆作PCR验证。

如图3 所示，利用质粒pMY-Cas9-TRP1-SC、pMY-Cas9-TRP1-SE未能成功敲除基因TRP1，转化子Pilsner-trp1和原始菌株Pilsner中扩增S.cerevisiae和S.eubayanus基因组中TRP1均为792和782 bp。

图3 基因TRP1未敲除验证电泳Fig.3 Electrophoresis of gene TRP1 not knockout verification

2.3 质粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE成功敲除基因TRP1

将构建成功质粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 和TRP1 修 复DNA TRP1-SC、DNA TRP1-SE 电转化入啤酒酵母Pilsner感受态细胞，电转化入啤酒酵母Pilsner感受态细胞，分别挑取单克隆作PCR验证。

如图4 所示，利用质粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 成功敲除基因TRP1，重组菌命名为Δtrp1。利用Δtrp1 扩增S.cerevisiae和S.eubayanus基因组中基因TRP1长度分别为117和107 bp，而原始菌株Pilsner 中扩增S.cerevisiae和S.eubayanus基因组中TRP1长度分别792和782 bp。因此，质粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 可敲除Lager 酵母Pilsner中基因。

图4 基因TRP1敲除验证电泳Fig.4 Electrophoresis of gene TRP1 knockout verification

3 讨论与结论

CRISPR-Cas9 系统是定向基因编辑的关键技术，可提高基因编辑效率，成本低廉、操作过程简单便捷。CRISPR-Cas9 系统在真菌中应用广泛，2013 年Dicarlo 等将CRISPR-Cas9 技术应用于S.cerevisiae[20]，单链和双链靶基因断裂效率大幅提升，Bao等将CRISPR-Cas9系统成功应用于S.cerevisiae中多基因敲除[21]。在啤酒工业中，Ale型啤酒酵母（S. cerevisiae）和Lager 型啤酒酵母（S. pastorianus）为典型菌株，而CRISPR-Cas9 系统在S.cerevisiae中应用成熟，但在Lager 型啤酒酵母中鲜有研究。Lager 型啤酒酵母由S.cerevisiae与S.eubayanus杂交，来源于S.eubayanus基因赋予啤酒酵母优良耐低温性能[22]。由于其染色体为杂倍体，一个基因常有多个等位基因，因此成为CRISPR-Cas9 系统在Lager型啤酒酵母中应用难点之一。在Lager型啤酒酵母基因功能研究中，使用经典同源重组技术无法将基因全部拷贝完全敲除，而利用CRISPRCas9 作目的基因敲除可将菌株中单个基因多个拷贝完全敲除，提高敲除效率。

本研究构建针对S.pastorianusCRISPR-Cas9 系统，通过带有特异性靶序列gRNA 引导Cas9 蛋白，对靶序列精准切割，产生DNA 双链断裂（Double strains break, DSB），再由修复DNA 与产生DSB 部位同源重组，实现基因定向改造。本试验采用TRP1 报告基因在S. pastorianus菌株Pilsner 中有两种不同序列，分别为TRP1-SC 和TRP1-SE，同源性为67.5%。因此在设计sgRNA时，无法在同源区找到合适sgRNA，需分别设计定位到基因TRP1 两种序列sgRNA和两种TRP1序列修复DNA。

质粒pRCC-K 通用于S.cerevisiaeCRISPR-Cas9系统质粒[23]，但不适用S. pastorianus目的基因敲除，该质粒导入目的菌株无法敲除目的基因（数据未显示）。推测是由于pRCC-K中SNR52为RNA聚合酶Ⅲ启动子，使RNA 聚合酶Ⅲ表达水平较低，不足以使Cas9蛋白切割靶向位点形成DSB[24]。因此为确保质粒中Cas9 基因高效表达，本试验将质粒pMY- Cas9- TRP1- SC、 pMY- Cas9- TRP1- SE、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 中gRNA 启动子替换为RNA 聚合酶Ⅱ启动子。RNA 聚合酶Ⅱ启动子直接转录sgRNA 会在5'和3'端形成多余结构，降低其活性，需在5'和3'端添加锤头状核酶和肝炎三角洲病毒核酶（Hepatitis delta virus ribozyme，HDV）识别位点序列。HH核酶和HDV 核酶用于介导特异性分子内裂解，确保质粒中启动子活性。HH 核酶结构5'端前6 个核苷酸与sgRNA 5'端前6个核苷酸互补形成茎环，作为HH核酶自切割位点。因此，在HH核酶和HDV核酶转录和自切割后，质粒中可产生活性sgRNA。

GAP是毕赤酵母（Pichia pastoris）表达外源蛋白质常用组成型启动子。Waterham 等首次成功分离GAP启动子，利用该启动子构建多种外源蛋白表达体系，表达周期短，表达效率高[25]。但GAP启动子表达系统多应用于P.pastoris，较少应用于S.cerevisiae或S. pastorianus。本研究使用GAP 启动子质粒pMY-Cas9-TRP1-SC 和pMY-Cas9-TRP1-SE，未能成功将S.pastorianus中靶基因TRP1 敲除。而位于S.cerevisiae 染色体Ⅲ上PGK1 是S.cerevisiae基因编辑中常用强启动子，因此选择PGK1启动子替换原有GAP 启动子。使用PGK1 启动子质粒pMYPGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 成功将S. pastorianus中靶基因TRP1 敲除。可知，较GAP启动子，来源于S. cerevisiae PGK1启动子更适合在S.pastorianus中启动基因表达。

Lager 酵母染色体杂倍特性使其基因编辑技术更新缓慢，不利Lager 酵母中非酿酒酵母基因功能研究。Lager 酵母中CRISPR-Cas9 技术成熟应用，促进Lager 酵母中不同来源基因功能研究。本研究建立适用于Lager 酵母基因编辑CRISPR-Cas9 系统，通过质粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE 和修复DNA 可敲除目的基因，但该系统基因敲除成功率提高与其在不同Lager酵母菌株中应用有待深入研究。