重组人碱性磷酸酶表达及其调节人白细胞释放TNF-α活性研究

惠觅宙，秦璐楠，高辰哲，薄 乐，刘天奇，吴书音，韩建春，翁晓刚，双 宝*

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

炎症是人体组织抵御外来有害物质入侵的非特异性免疫反应，主要由血液中白细胞渗出到血管外患处释放炎症因子（如TNF-α 等）造成。TNFα是一种哺乳动物分泌的蛋白，是体内炎症反应的初始细胞因子，具有调节免疫反应和促进炎症作用。TNF-α促进多种炎症因子（如IL-1、IL-6）释放，与炎症发展密切相关。其中，外来微生物通过裂解产生内毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和Toll-样受体4（Toll-like receptors4，TLR4）结合造成组织炎症损伤。皮肤和黏膜红肿硬痛为体表炎症常见表现。炎症参与人类疾病的病理过程，肥胖、心脑血管疾病和代谢性疾病，近年来均被定义为炎症性疾病（Inflammatory diseases）。

碱性磷酸酶分多个亚型（TNAP、IAP、PLAP），广泛分布于人体不同组织，包括心[1]、脑[2]、胎盘血管上皮细胞[3]、肠道黏膜[4]和肝脏细胞等[5]。1997年荷兰科学家Poelstra 等首次报道分布在小肠黏膜表面的肠碱性磷酸酶（IAP）可灭活肠道内大肠杆菌裂解产生的LPS，阻止LPS 与TLR4 受体结合[6]。Bhan 和Sonoko 通过敲除肠碱性磷酸酶基因发现，无肠碱性磷酸酶动物易患糖尿病和高血脂[7-8]。荷兰生物制药公司AM-Pharma 的Peters 和Lukas 使用重组人肠碱性磷酸酶治疗内毒素相关脓毒血症肾损伤和结肠炎[9-10]。

目前碱性磷酸酶是否可通过体内其他核酸产物的脱磷调节TNF-α释放尚不明确。本研究采用黑曲霉和CHO 动物细胞表达技术生产和制造重组人肠碱性磷酸酶（recAP），进一步研究recAP 是否具有抑制炎症因子TNF-α分泌的生物活性，分析细胞内除LPS外其他酶反应基质，旨在扩大重组人肠碱性磷酸酶临床应用范围并明确相关机制，为炎症性疾病治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体

因此，投放调味品的种类和数量皆不可乱来。特别是对于多味菜，必须分清味的主次，才能恰到好处地使用主、辅调料。

出发菌株黑曲霉菌株TH-2由肇东市日成酶制剂有限公司提供。大肠杆菌DH5α及农杆菌AGL1和pT-Tgla、pT-6R 由东北农业大学生命科学学院真菌遗传实验室提供。pMD-19T由TaKaRa试剂公司提供。 中国仓鼠卵巢细胞CHO、recAP 模板质粒和pMH3-PLAP 质粒由绍兴惠荟生物有限科技公司提供。本试验构建碱性磷酸酶黑曲霉表达载体pSZH-ChimAP和CHO重组表达载体pMH3-ChimAP。

1.1.2 试验材料与药品

围墙板材采用AS装配式墙板，现场装配施工。每个柱距布置3块AS装配式墙板，底部1块为宽1 000 mm墙板，上面两块为宽500 mm墙板。AS装配式围墙两面无需处理，板与板之间的缝隙、围墙板与槽口的缝隙均使用嵌缝剂做板缝处理。

引物由博仕生物公司合成；限制性内切酶、T4连接酶购自TaKaRa 试剂公司；鲑鱼精DNA 购自ThermoFisher 公司；电转杯、电转仪购自Bio-Rad公 司；DMEM/F-12 培 养 基、G418 购自Gibico 公司；Hygromycin B、PRMI-1640培养基、LPS（大肠杆菌0111：B4）、bIAP（P6774-2KU）购自Sigma 公司；抗生素、DNA Marker、Protein Marker 购自上海生物工程有限公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、基因组提取试剂盒购自康为世纪生物公司；阳离子柱sp XK50、阴离子柱Q XK50柱购自美国GE Healthcare公司；磷酸苯二钠比色法试剂盒（TE0007）购自北京雷根生物技术有限公司；试管定量基质显色法鲎试剂盒（EC32545S）购自厦门鲎试剂生物科技有限公司；ATP、腺苷购自上海源叶生物科技有限公司；无机磷测试盒（C006-1-1）购自南京建成生物工程研究所；人静脉血白细胞分离试剂盒（内毒素<0.1 EU）购自天津灏洋华科生物科技有限公司；TNF-α检测试剂盒购自美国R&D system公司。

1.2 方法

1.2.1 重组人肠碱性磷酸酶表达与纯化

1.2.1.1 基因克隆

收集细胞培养液离心过滤，30 ku 膜包浓缩约6 倍。利用sp XK50 离子交换柱纯化除杂蛋白。收集流穿液通过Q XK50 离子交换柱作无热原处理，纯化后目的蛋白SDS-PAGE 检测结果如图5 所示。HPLC 法检测蛋白纯度为92.45%，结果如图6 所示。按照碱性磷酸酶活性检测试剂盒（磷酸苯二钠比色法）测定其活性为140.125 U·mL-1。

以pMD19T-ChimAP 质粒[11]为模板，引物扩增基因片段，将扩增片段琼脂糖胶回收纯化，连接转化。提取质粒经XbaⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后送测。得到各基因测序结果与已知Blast 序列对比，比对正确质粒分别命名为pMD 19T-ChimAP。

比如在学习初中数学《轴对称图形》这一知识点时，在实际教学中，教师可鼓励学生结合之前积累的知识内容，使用多媒体为学生展示蝴蝶、窗花、表盘等生活中常见的轴对称图形。在教学中，教师在展示这些图形后，可以让学生从数学角度探索轴对称图形的特点。同时在课堂中教师讲解完轴对称知识概念后，教师还可引导学生进一步思考，以体会数学艺术特征，并且感受到现实生活同数学知识间的联系。通过这样的教学设计，激发学生主动思考的兴趣，同时让学生在探索过程中掌握轴对称图形的相同点。

1.2.1.2 构建碱性磷酸酶表达载体

将流穿液上样至平衡液（20 mmol·L-1Tris+50 mmol·L-1NaCl pH 7.5）平衡后的阴离子柱Q XK50柱，采用预洗液（20 mmol·L-1Tris + 200 mmol·L-1NaCl pH 7.5）预洗调零，洗脱液（20 mmol·L-1Tris+1 mol·L-1NaCl pH 7.5）洗脱，收集洗脱峰，采用SDS-PAGE 电泳与高压液相色谱法（HPLC）检测洗脱液中recAP蛋白。

（2）激光淬火前准备 清洗缸筒工件表面的油污、杂质等，并确保激光淬火部位表面外观质量；缸筒激光淬火部位表面粗糙度较高，表面均匀涂上SiO2激光吸光涂料，减小缸筒表面激光的发射来保证激光的吸收率；缸筒激光淬火前烘干涂层，为后续激光淬火做准备；检验设备的工作状态，保证淬火过程中设备的正常运行。

1.2.1.3 黑曲霉重组菌株的筛选及鉴定

取500 μL 农杆菌AGL1 菌液制备农杆菌感受态，取1 μL 重组质粒DNA 加入农杆菌感受态中，通过冻融法转入农杆菌。选取少量多个单菌落为模板，使用引物glaA-sense 和glaA-antisense 作PCR鉴定，通过电泳检测阳性农杆菌转化子[12]。将获得的农杆菌转化子与打碎的受体黑曲霉菌丝共培养并筛选，吸取生长足量且良好菌丝，CTAB法提取其基因组DNA。以基因组DNA 为模板，利用糖化酶引物扩增鉴定。以ddH2O为阴性对照，原始菌株基因组DNA 和对应转入的重组表达载体质粒为阳性对照。

1.2.1.4 CHO稳定细胞株筛选及扩大培养

取状态良好CHO 细胞与20 μg 线性化载体（PvuⅠ酶切）及5 μL鲑鱼精混匀后加入电转杯，电击转化后将细胞转移至2个含10 mL培养液的Φ100 mm培养皿中培养。24 h后更换含有适当浓度G418的筛选培养基，48 h 后更换培养基，用G418 继续筛选。待单细胞长成集落斑点后，10 μL枪头滑动挑取至96 孔板。待细胞大致长满，换成无血清B001 培养基，24 h 后取培养液适当稀释，磷酸苯二钠比色法检测碱性磷酸酶活性。选取检测表达量相对较高的细胞克隆，转移至24 孔板备份。传代1～2 周后，检测B001 24 h 表达量。选取高表达克隆2 次筛选，步骤同1 次筛序。经2 次克隆筛选出高表达细胞，扩大培养至T 25 中，比较获得高表达克隆株，命名为CHO-recAP 细胞株。将CHO- recAP 细胞株作为收获蛋白种子细胞系，扩大培养至20 L 生物反应器中，细胞活率低于80%时，收获丰收液。

至于未来的40年会发生什么，我无从知道。但我唯一确定的是，在这场迄今人类最宏大、最能体现智慧光芒与勇气胆识的艰难探索中，需要你，需要我，更需要每个自然资源人的努力。

1.2.1.5 目的蛋白纯化

收获丰收液3～5 L，采用4 750 r·min-1离心6 min，取离心上清液过滤，3 层滤膜孔径分别为0.8、0.45、0.22 μm。采用Millipore 30 ku膜包将过滤后上清浓缩换液，置换液为阳离子柱sp XK50平衡缓冲液。上样至平衡液（20 mmol·L-1NaAc-HAc + 50 mmol·L-1NaCl pH 5.4）平衡后的阳离子柱sp XK50，吸光值增大时收集流穿液。洗脱液（20 mmol·L-1NaAc-HAc+1 mol·L-1NaCl pH 5.4）洗脱阳离子柱上杂蛋白。

构建黑曲霉表达载体过程为：利用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ对质粒pMD 19T-ChimAP 双酶切，回收基因片段；利用限制性内切酶Nhe Ⅰ和HindⅢ对质粒pSZH6R双酶切，回收载体片段。回收片段连接并转化培养至产生抗性菌落。用XbaⅠ和HindⅢ双酶切鉴定大肠杆菌转化子，正确的转化子命名为pSZH-ChimAP。

1.2.2 recAP抗炎活性测定

1.2.2.1 碱性磷酸酶活性检测

使用Tris-HCl（50 mmol·L-1，pH 7.0～8.0）缓冲液配制10 mmol ATP，稀释recAP至0.5 U·mL-1。取950 μL recAP 和50 μL ATP 溶液混合均匀（溶液终浓度均为0.5 mmol），37 ℃孵育60 min。使用无机磷测试盒检测不同pH 7.0～8.0 recAP 对ATP（0.5 mmol）释放的游离磷Pi含量。释放Pi与钼酸作用生成磷钼酸，磷钼酸被还原为钼蓝，在660 nm处有最大吸收峰值。以上测定以65 ℃处理60 min 失活recAP作空白对照。

构建CHO 表达载体过程为：用限制性内切酶Eco RⅠ和NotⅠ对质粒pMD 19T-ChimAP 双酶切，回收基因片段；利用限制性内切酶Eco RⅠ和NotⅠ对质粒pMH3-PLAP双酶切，回收载体片段。回收的两片段连接并转化培养至产生抗性菌落，Eco RⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，正确的命名为pMH3-ChimAP。

使用磷酸苯二钠比色法测定碱性磷酸酶活性。磷酸苯二钠在碱性条件下被碱性磷酸酶水解，形成游离酚和磷酸。在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成深浅不一红色醌式结构物。在510 nm处检测吸光值，通过比色分析计算碱性磷酸酶活性水平。1个活性单位定义为37 ℃下100 mL 待测样品与磷酸苯二钠作用15 min，产生1 mg酚为1个金式单位（U·L-1）。

在港口发展方面，江海联动、功能互补的港口服务体系初步形成。一批专业化、现代化水平较高的大型综合性港区正在崛起，干线港口规模化、集约化、专业化水平不断提升，以南宁、贵港、梧州、肇庆、佛山等主要港口为核心的内河港口体系逐步形成。截至2017年年底，珠江水系拥有生产用泊位2092个，港口年综合通过能力超过6 亿吨；货物综合通过能力超过1000 万吨的港口总数达11个。

1.2.2.2 重组人肠碱性磷酸酶测定LPS灭活效果

使用Tris-HCl（50 mmol·L-1，pH 7.4）缓冲液将recAP 稀释为50 U·mL-1。生理pH 7.4 条件下，recAP（酶活为1、5、10 U·mL-1）与LPS（5 ng·mL-1）37 ℃孵育3 h，通过鲎试剂显色法测定545 nm处吸光值，与标准曲线对比确定LPS含量。以上测定以65 ℃下处理60 min失活的recAP作空白对照。

1.2.2.3 磷钼酸法测定ATP游离磷释放量

用ZMD-2型电子密度计，采用排水法测量烧结试样的烧结密度；用Leica DM4000型显微镜，对烧结试样的横截面进行孔隙度测试；用DM400M型金相显微镜，对烧结试样进行显微组织分析；用HR-150A型洛氏硬度计，测量试样的硬度(HRB)．

1.2.2.4 人静脉血白细胞分离

健康志愿者共6 人，男女各半，年龄26±5岁，经长春嘉和外科医院医学伦理委员会批准和本人同意。本研究采用糖密度梯度离心法，使用人静脉血白细胞分离试剂盒分离静脉血中白细胞。常温下采集人静脉血1 800 r·min-1离心25 min，吸取单核细胞层（淋巴细胞和少部分单核细胞）和多核细胞层（中性粒细胞为主）混合，充分裂解红细胞，反复清洗2次，用3 mL 含10%FBS 的1 640培养基重悬。采用白细胞分类染色液染色观察细胞形态，调整密度至1×106cell·mL-1，备用。每次采集不同志愿者的血液排除个体差异，确保试验可重复，至少重复3人。

1.2.2.5 人白细胞分泌炎症因子TNF-α

人脐静脉内皮细胞系（HUVECs）用含有10%FBS 的DMEM/F 12 培养基37 ℃贴壁培养，胰蛋白酶消化悬浮，调整细胞密度至1×105cell·mL-1。每孔加入细胞100 μL，接种于96 孔板，37 ℃培养24 h。试验当天，将新鲜提取的人静脉血白细胞加入单层培养的HUVECs 96 孔板中，建立白细胞和HUVECs模型。试验完成后，新鲜提取另一人静脉血白细胞重复试验，确保结果可重复。

预先将recAP（5 U·mL-1）与LPS（0.5 ng·mL-1）提前孵育3 h后加入细胞培养物中刺激白细胞。37 ℃培养24 h 后，收集上清液，检测TNF-α 蛋白水平。低浓度（0.10、0.25、0.50 μmol）腺苷被加入白细胞和HUVEC 细胞模型，24 h 后收集培养上清，确定TNF-α 水平。使用ELISA测定试剂盒（TNF-α Elisa 试剂盒，R＆D system，DY210）测量细胞培养基中TNF-α。有关特定方法和步骤参阅制造商说明。

1.2.2.6 统计学分析

数据以平均数±标准差表示，采用Graph prism 6.0统计软件作t检验比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 重组人肠碱性磷酸酶表达

2.1.1 ChimAP基因克隆

以pMD 19T-AP质粒为模板基因片段。连接转化后，大肠杆菌转化子双酶切鉴定。测序正确质粒命名为pMD 19T-ChimAP（见图1）。

图1 基因ChimAP PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of genes ChimAP

2.1.2 碱性磷酸酶表达载体构建

话是这么说，那天我还是生气了。一想到佟老板的飞扬跋扈，我就气不打一处来。佟老板的话听着文质彬彬，细想全是无赖话。

根据山西省工业布局和区域经济社会发展对水资源需求的紧迫程度，“十二五”期间先期开工四大骨干工程：一是从清漳河和浊漳河调水连接汾河，解决晋中南部盆地的祁县、太谷、平遥、灵石、介休等5个县用水需求的东山供水工程；二是由漳河辛安泉向长治盆地郊区、平顺、屯留、黎城等8个区县调水的辛安泉引水工程；三是解决国家集中贫困区吕梁革命老区4市16县供水问题的中部引黄工程；四是小浪底向运城盆地涑水河流域的调水工程，解决运城盐湖、闻喜、绛县、夏县、垣曲5个区县的用水问题。

用XbaⅠ和Hind Ⅲ鉴定黑曲霉表达载体pSZHChimAP 时，电泳结果显示1 500 bp，15 000 bp 片段，下一步通过根癌农杆菌介导转入黑曲霉鉴定，如图2A 所示。同理，用Eco RⅠ和NotⅠ鉴定CHO表达载体pMH3-ChimAP时，电泳结果显示出1 500、8 453 bp 片段，下一步转入CHO 细胞中筛选，如图2B所示。

图2 表达载体鉴定结果Fig.2 Identification results of expression vectors

2.1.3 重组黑曲霉菌株筛选及鉴定

图3a 结果表明，表达载体成功转入并获得含重组质粒农杆转化子。将农杆菌转化子与黑曲霉共培养并筛选，吸取足量菌丝，提取其基因组DNA。用PCR 鉴定同源重组转化子，结果见图3B和C，未获得含碱性磷酸酶基因重组菌株。

2.1.4 CHO稳定株筛选及扩大培养

线性化pMH3-ChimAP 转染CHO 细胞，G418加压筛选5～8 d后挑取单克隆至96孔板。待长满后挑取表达量高的转入24 孔板，经一段时间传代后检测表达量。挑选6 个表达量高的克隆二次筛选，步骤同1次。将24孔板中培养基更换为无血清培养基表达24 h，最终获得5株表达量高且稳定的高纯度细胞克隆，分别为：B8A11、B8A12、G5D10、D8A1、G5A1，酶 活 分 别 为904.072、887.221、988.327、849.307、847.200 U·mL-1。从24 孔板扩培至T25中，冻存细胞。继续扩大培养收液。具体筛选流程如图4所示。

图3 重组黑曲霉转化子PCR产物酶切鉴定（HindⅢ）Fig.3 Identification of PCR products by enzyme digestion（HindⅢ）

图4 稳定株筛选流程与结果Fig.4 Result of the stable CHO cells after selection

2.1.5 目的蛋白纯化及活性检测

所选取患者在治疗过程中均未出现严重不良症状,观察组中有1例患者出现恶心症状,所占比例为2.50%,对照组中有1例患者出现恶心症状,1例患者出现头痛症状,所占比例为5.00%,两组数据没有明显差异存在(X2=0.866,P=0.352)。

图5 蛋白SDS-PAGE检测Fig.5 SDS-PAGE detection of recAP

图6 蛋白HPLC检测Fig.6 HPLC detection of recAP

2.2 碱性磷酸酶抗炎活性研究

2.2.1 碱性磷酸酶对LPS活性的影响

而且今年，我们还很高兴邀请到了专攻新西兰葡萄酒的专家，刘玲女士辅助David作翻译讲解。David的专业讲解，刘玲老师在翻译之余也时不时抛出自己的经验和种种干货，让参与嘉宾赞声连连。也难怪有嘉宾表示：“内容很多干货。看得出大师选酒很用心。每款酒都能代表产区特色、品种风格，哪怕是同样品种，不同酒款的特色也很鲜明，让我们深入感受到，个性新西兰，何止长相思。”

2001-2012年海南省入境旅游者人均天消费总体呈波动上升趋势，增长了30.03美元，排名从第二十五名上升至第二十名。人均天消费与全国平均值差距越来越小，缩小了9.3美元。其中外国游客人均天消费增长了20.9美元，港澳台游客人均天消费增长了146.6美元。同时，港澳台游客人均天消费的增长量大于外国游客，约是外国游客的5倍。其12年间增长的速度也比外国游客增长的速度快，增长了8.65%。海南省入境旅游者人均天消费构成中，长途交通所长比重较大。2012年海南省入境旅游者人均天消费主要在提高层次方面的消费，在购物和娱乐方面消费较多，说明海南省旅游业发展越来越健康。

37 ℃孵育3 h 后，recAP（1 U·mL-1）使LPS（5 ng·mL-1）活力降低30%左右。recAP（5 U·mL-1）使LPS 活力降低40%左右。recAP（10 U·mL-1）使LPS 活力降低60%左右。结果表明recAP 为剂量依赖型有效灭活内毒素，如图7所示。

图7 内毒素活性检测Fig.7 Detection of LPS activity

2.2.2 建立人白细胞TNF-α模型

在船闸建设方面，长洲枢纽三线四线船闸、老口枢纽船闸、桂平枢纽二线船闸、邕宁枢纽船闸的建成运行，打通了上游关键节点。其中，三线四线船闸投用后，长洲枢纽船闸总通过能力提升至1.36亿吨（单向），成为世界上通过能力最大的单级船闸。此外，龙滩水电站、百色枢纽通航设施建设取得新突破，有望在“十三五”期间开工建设。

使用增加剂量的LPS（0.05、0.10、0.50 ng·mL-1）刺激人白细胞和HUVECs 细胞，24 h 后收集培养液上清，检测TNF-α 水平。LPS 可刺激TNF-α 分泌水平呈剂量依赖型增加，表明成功建立低浓度LPS 刺激人白细胞TNF-α 模型，结果如图8所示。

图8 人白细胞TNF-α 模型建立Fig.8 Establishment of human leukocyte TNF-α model

2.2.3 碱性磷酸酶对白细胞分泌TNF-α的影响

与空白组相比，0.5 ng·mL-1LPS明显增加TNF-α分泌。recAP 明显抑制LPS 诱导的人白细胞TNF-α产生。在LPS 不存在情况下，recAP 也明显抑制TNF-α 产生，结果如图9 所示。以上结果表明，recAP酶反应基质不只LPS一种。

图9 碱性磷酸酶对TNF-α 的影响Fig.9 Effect of alkaline phosphatase on TNF-α

2.2.4 碱性磷酸酶使ATP去磷酸化

在pH 7.0～8.0 时，recAP 有效使ATP 脱磷，脱磷作用存在pH 依赖。ATP 经recAP 脱磷后产生终产物腺苷，结果如图10所示。

图10 游离磷释放量检测Fig.10 Detection of free phosphatase

2.2.5 腺苷对白细胞分泌TNF-α的影响

与空白组相比，腺苷明显抑制生理状态下人白细胞TNF-α 产生，证明recAP通过使ATP脱磷产生腺苷间接抑制TNF-α 释放，结果如图11所示。

图11 腺苷对TNF-α的影响Fig.11 Effect of adenosine on TNF-α

3 讨 论

目前嵌合型人碱性磷酸酶基因ChimAP（人胎盘碱性磷酸酶耐热部分+人肠道碱性磷酸酶活性部分）基因在黑曲霉中表达尚无报道。研究利用农杆菌介导法与黑曲霉共培养，发现黑曲霉生长速度缓慢，最终未获得含ChimAP的黑曲霉重组菌株。由于碱性磷酸酶为一种非特异性脱磷酶，推测AP 可能影响黑曲霉生长相关信号传导通路。CHO 细胞为目前最常用的生产治疗蛋白的哺乳动物宿主。研究利用电穿孔法将ChimAP转入CHO细胞，筛选5个稳定表达细胞株，但表达量较低，后续研究会加大筛选效率，提高产量[13]。经20 L生物反应器培养14 d后获得丰收液，丰收液过滤纯化后获得recAP酶活为140 125 U·L-1，比活性为578 U·mg-1。CHO细胞表达生产的recAP可呈剂量依赖型灭活LPS[14]。

Peters等利用肾上皮细胞，发现recAP减轻LPS诱导体外炎症反应[15]。研究建立人白细胞和HUVECs分泌炎症因子TNF-α 抗炎生物活性模型[16]，发现recAP 对LPS 诱导的人白细胞TNF-α分泌有明显抑制作用，与Peters等研究结果接近。但研究发现在LPS 不存在情况下，recAP 仍有明显抑制作用，表明recAP 对人白细胞TNF-α抑制作用不仅通过LPS，还通过其他底物。体内外试验发现腺苷抑制LPS 诱导TNF-α产生[17]。研究发现在LPS 不存在情况下，腺苷呈剂量依赖型抑制人白细胞TNF-α。表明ATP为recAP靶向底物之一，其脱磷终产物腺苷发挥抗炎作用。除ATP外，recAP还可能通过其他基质脱磷产生抑制人白细胞分泌炎症因子TNF-α作用，推测包括细胞核酸DNA 和RNA 降解产物。以上基质的脱磷终产物均可能为recAP 脱磷底物，并参与recAP对TNF-α 分泌的抑制作用。

4 结 论

试验筛选出一株稳定表达recAP 的CHO 细胞株。经生物反应器生产和丰收液纯化后，获得recAP 纯度为92.45%，比活性为578 U·mg-1，有效灭活LPS。recAP在生理pH范围内对ATP去磷酸化作用显著。试验结果表明recAP对TNF-α分泌的抑制作用不依赖LPS，除LPS外还通过ATP去磷酸化产生腺苷抑制人白细胞炎症因子TNF-α 分泌。本研究可扩大recAP 临床应用范围，建立非LPS依赖的recAP抑制人白细胞TNF-α 产品活性测定方法。