猪SIgA分泌片的表达及其多克隆抗体的制备

朱利塞，贾爱卿，王贵平，王 娟，李 菲，邓胜朝，钱雪桥，丁 壮

（1.广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心 海大中央研究院 农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室，广州 511400；2.广东海大畜牧兽医研究院，广东 511400；3.吉林大学动物医学学院，长春 130062）

黏膜免疫主要分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜及一些外分泌腺体的淋巴组织，是机体免疫系统的第一道防线。分泌型IgA（secretory immunoglobulin A，SIgA）是黏膜免疫的主要免疫球蛋白，能阻止病原体粘附于肠道上皮细胞[1-4]，也可以通过直接识别受体的结构域来阻断病原体附着到肠上皮细胞。因此，SIgA成为评价黏膜免疫的重要指标[5-9]。

SIgA由2个单体IgA、J链及分泌片组成[10]，分泌片（secretory component，SC）是一个大小约为80 kDa的糖蛋白，SC的存在可以防止SIgA被蛋白酶类降解[7]，分泌片SC蛋白是SIgA的特有成份，可用于区分SIgA和IgA免疫球蛋白，也可通过SC蛋白对SIgA的含量进行评价。目前，人们获得猪SC的方法是从猪初乳中分离纯化，但该方法纯化工艺繁琐、成本较高、获得的量较少。本研究通过原核表达获得大量的重组rSC，并制备抗rSC的多克隆抗体，发现抗rSC的多克隆抗体可以与天然存在的SIgA发生特异性结合，重组蛋白rSC及其多克隆抗体的制备为进一步深入研究SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 组织、抗体及实验动物 小肠组织为新鲜采集的组织脏器，兔抗SIgA的抗体为第一作者实验室制备保存。2～3 kg新西兰兔购自南方医科大学。

1.2 主要试剂 pGM18-T载体，BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶及TaqDNA聚合酶购自大连宝生物有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，RNA提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GeneBank的参考序列，设计扩增SC基因片段的引物，上、下游引物引入的酶切位点分别为BamHⅠ和SalⅠ，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。

表1 SC基因的扩增引物Table 1 Primers used for amplification of the SC gene

1.4 小肠组织总RNA的提取及RT-PCR扩增 采集新鲜小肠组织进行研磨，取研磨上清液进行组织RNA的提取，RNA的提取方法参照（Omega公司）RNA提取试剂盒操作说明；cDNA的合成按照（TOYOBO）的试剂盒进行；以高保真的DNA聚合酶进行SC基因片段的扩增。扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 S，60℃退火30 S，72℃延伸100 S，30个循环；72℃再延伸10 min。利用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行鉴定。

1.5 原核表达质粒的构建 将回收的PCR片段克隆到pGM18-T载体上，获得的重组质粒pGM18-T-SC测序验证SC基因片段正确后，再将其连接至pGEX-4T-1原核表达载体上，经酶切和测序验证获得阳性原核表达质粒pGEX-4T-1-SC。

1.6 重组蛋白rSC的表达、鉴定与纯化 将重组质粒pGEX-4T-1-SC转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，16℃诱导20 h，诱导后收集菌体进行SDS-PAGE，获得的重组蛋白命名为rSC。以兔抗猪SIgA的抗体为一抗，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG的抗体，对表达的重组蛋白rSC进行Western blot分析。Western blot验证重组蛋白正确后，通过SDS-PAGE对重组蛋白rSC的表达形式进行验证，经鉴定重组蛋白rSC在上清液和包涵体中均有表达，由于pGEX-4T-1载体存在GST标签，所以本研究参照GST琼脂糖纯化蛋白的标准方法，纯化上清液中的重组蛋白rSC。

1.7 rSC多克隆抗体的制备与反应性鉴定 将纯化的重组蛋白rSC与等体积的弗氏佐剂混合后进行乳化，以100 μg/公斤剂量皮下多点免疫兔子，首免后第21 d进行二免，二免后第14 d进行三免，三免后采集血液，收集抗SC的血清。通过Western blot分析抗rSC的多克隆抗体的反应性，将其分别与SIgA和IgG进行反应，rSC的多克隆抗体作为一抗，二抗为商品化的HRP标记的羊抗兔IgG。

2 结果

2.1 SC基因的扩增 应用RT-PCR扩增SC基因片段，扩增的条带利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增条带的大小与预期大小相符，约为1755 bp，见图1。

图1 SC基因片段的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of SC gene

2.2 SC重组质粒的构建 将SC基因片段克隆到pGM18-T载体上进行测序，序列正确后将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上，获得的重组质粒pGEX-4T-1-SC利用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切验证，获得与预期大小相符的片段，如图2所示。

图2 pGEX-4T-1-SC重组质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of pGEX-4T-1-SC plasmid by double digestion

2.3 SC重组蛋白的诱导表达 将序列正确的重组质粒pGEX-4T-1-SC转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，16℃诱导20 h，与未诱导组比较，诱导组表达出与预期大小相符的蛋白条带，蛋白大小约为90 kDa，如图3所示。

2.4 rSC蛋白的Western blot分析 为了验证表达出的蛋白条带为正确的重组蛋白，利用Western blot对重组蛋白进行验证，一抗为保存的兔抗猪SIgA的多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，与空载体对照组相比，pGEX-4T-1-SC质粒的诱导组显示出单一的特异性条带，且大小正确，约为90 kDa，如图4所示。

图3 重组蛋白rSC的诱导表达Fig 3 Expression of recombinant protein rSC

图4 重组蛋白 rSC的Western blot鉴定Fig.4 Identification of recombinant protein rSC by Western blot

2.5 重组蛋白rSC的纯化 将诱导表达后的菌体沉淀进行超声破碎，利用SDS-PAGE分别对上清液和沉淀分析可知，重组蛋白rSC在上清液中表达，应用GST琼脂糖对重组蛋白rSC进行纯化，纯化后经SDS-PAGE分析发现，重组蛋白rSC的纯化效果较好，如图5所示。

2.6 rSC多克隆抗体的反应性鉴定 将纯化后的rSC重组蛋白乳化后免疫兔子制备多克隆抗体，利用间接ELISA的方法分别测定免疫前和免疫后兔血清的滴度，并采集第三次免疫后滴度较高的兔血清。为了验证抗SC重组蛋白的多克隆抗体是否能特异性识别初乳中的SIgA，利用Western blot进行验证，一抗为兔抗重组蛋白rSC的多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，结果如图6所示。在SIgA泳道出现大小约为80 kDa单一条带，该条带大小与分泌片大小相同，而IgG泳道没出现任何条带，表明抗重组蛋白rSC的多克隆抗体与SIgA发生特异性结合。

图5 重组蛋白rSC的纯化Fig.5 Purification of recombinant protein rSC

图6 重组蛋白rSC的多克隆抗体的反应性鉴定Fig.6 Identification of polyclonal antibody against recombinant protein rSC

3 讨论

据报道在胃肠道，呼吸道和泌尿生殖道的黏膜表面约有100万亿个微生物定居[11]。许多病原体通过黏膜表面侵入机体并造成损伤。黏膜免疫系统是病原体进入机体的第一道防线，可以将外来病原微生物或外来抗原在侵入机体组织前被消灭，IgA是黏膜免疫中最丰富的免疫球蛋白，在血液循环中IgA以单体或聚合的形式存在，聚合的IgA通过J链聚合连接在一起，而SIgA是由J链和分泌片（SC）连接的二聚体，仅存在于黏膜表面[10]，SIgA可以与病原体结合，防止病原体粘附在黏膜表面[5]。因此，SIgA在肠道、呼吸道和泌尿生殖道黏膜上皮细胞的保护和稳态调节中发挥重要作用。

SIgA是评价黏膜免疫的重要指标，SC是SIgA的特有的成分，可以通过抗SC的特异性抗体识别SIgA。SC可以从猪初乳中分离纯化，但初乳的采集受条件约束，且初乳中SC的含量有限，纯化步骤繁琐，需要进行多步纯化，如分子筛层析、离子交换层析、凝胶层析等。本研究根据GenBank提交的SC序列，利用生物信息学软件分析其信号肽、抗原性及跨膜区，设计表达SC蛋白的引物，从猪小肠组织中扩增出SC基因片段，构建pGEX-4T-1-SC的重组表达质粒，利用大肠杆菌BL21和IPTG，诱导重组蛋白rSC的大量表达。参照正常的免疫程序免疫新西兰大耳白兔，获得抗重组蛋白rSC的多克隆抗体。Western blot结果显示抗rSC蛋白的多克隆抗体可以与猪初乳中SIgA发生特异性结合，该抗体的获得为进一步建立猪初乳中SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定了基础。