1株宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌噬菌体的分离及生物学特性分析

孙利厂，周 艳，张莉莉，庞茂达，何 涛，包红朵，张 辉，何灵尘，王 冉

（江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所 江苏省食品质量安全重点实验室 省部共建国家重点实验室培育基地，南京 210014）

肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）是产志贺毒素大肠杆菌（shiga-toxin producingEscherichia coli，STEC）的一类亚群，1982年被证实是一种重要的人畜共患病原菌[1]。EHEC广泛分布于自然界的土壤、水和农产品及林产品中，常定植在人和动物的肠道及呼吸道，可以引起人不同程度腹泻、出血性结肠炎等，严重的可导致死亡[2-3]。EHEC是典型的条件致病菌，常于动物抵抗力下降时引起暴发性流行，如鹅腹泻、家兔的肠炎、雏鸡腹泻、绵羊的传染性口炎、大熊猫的腹泻、猪腹泻等[4-6]。

噬菌体是一种可杀灭细菌的病毒，已被科学家作为对付多重耐药菌新的希望，因此也成为了当前的研究热点。同时，伴随当前细菌耐药性越来越强，且新型抗生素研发困难，使得噬菌体作为抗生素的替代品重新受到关注。本研究分离获得1株宽噬菌谱裂解性肠出血性大肠杆菌噬菌体，并分析了其生物学特性及体外杀菌特性，为研制肠出血性大肠杆菌噬菌体防控产品提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 菌种、培养基与试剂 实验用菌种ATCC 35150、CCTCC AB 200051、ATCC 12795、ATCC BAA-2469、ATCC 23982、ATCC 29552、ATCC BAA-2190、ATCC BAA-2216由本实验室保存；污水样品采集自南京及周边养殖场。LB培养基、琼脂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；聚乙二醇8000（polyethylene glycol, PEG8000）、氯仿、盐酸、NaCl购自南京知凡生物技术有限公司；灭菌规格板BZS50515购自南京便诊生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备 HZL-F160全温振荡培养箱购自太仓市强乐实验设备有限公司；5810R台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；DHP-9052电热恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司；HFU486Basic超低温冰箱购自德国Thermo公司；DELTA320 pH计购自瑞士Mettler Toledo公司；SW-CJ-1F超净台购自苏州真田洁净设备有限公司。

1.3 噬菌体的富集 参照本研究室前期采用的方法[7]：以肠出血性大肠杆菌ATCC 35150为宿主菌分离噬菌体在南京及周边养殖场采集污水样品，水样经过滤除菌，将滤液和宿主菌ATCC 35150在LB培养液中共培养，进行噬菌体扩增富集。

1.4 噬菌斑的纯化及噬菌体颗粒制备 参考文献[8]报道方法进行单层平板点样实验，挑选具有明显溶菌空斑的样品，进行双层平板实验[9]。噬菌体颗粒沉淀采用PEG/NaCl提取方法进行制备[10]，噬菌体纯化后保存于4℃备用。

1.5 噬菌体宿主谱分析实验 参考文献[11]报道方法分析噬菌体噬菌谱。分别检测噬菌体对以下菌种的裂解活性：ATCC 35150、CCTCC AB 200051、ATCC 12795、ATCC BAA-2469、ATCC 23982、ATCC 29552、ATCC BAA-2190、ATCC BAA-2216，并统计各细菌的裂解情况。

1.6 噬菌体透射电镜观察 参考文献[9]报道方法进行透射电镜观察样品制备，完成样品制备后，采用日立H7650型透射电子显微镜观察。

1.7 噬菌体酸碱稳定性和热稳定性的测定 参照本研究室前期采用的方法[7]，pH值分别设置为：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12；温度检测设置为：30、40、50、60、70、80℃，测定噬菌体效价变化。

1.8 噬菌体一步生长曲线实验分析 参考Leuschner等[12]方法，绘制一步生长曲线。

1.9 噬菌体vB_EcoM_C1控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染 以奶牛场作为试验地点，选择肠出血性大肠杆菌ATCC 35150临床株为试验菌株，将浓度为105CFU/mL的肠出血性大肠杆菌取1 mL均匀喷洒在料槽表面（1 m2），然后以1 mL浓度为108PFU/mL噬菌体vB_EcoM_C1（培养基为LB液体培养基）对料槽表面实施喷杀1 h后，使用平板计数法检测料槽表面肠出血性大肠杆菌的数量。在料槽表面随机取3个样品，将5 cm×5 cm的灭菌规格板放于料槽表面，在取样范围内将沾有无菌生理盐水的灭菌棉棒反复擦拭10次，取样后迅速将棉棒放入装有10 mL无菌生理盐水的密闭三角瓶中，立即置于摇床室温孵育30 min（80 r/min），然后进行10倍梯度稀释，在LB平板上培养计数，检测采集到的肠出血性大肠杆菌数目，最终计数结果取3处平均值。

2 结果

2.1 噬菌体的分离纯化及其噬菌斑形态、透射电镜观察 37℃培养12 h，在LB培养平板上V_EcoM_C1噬菌斑直径为1.0～1.5 mm。由图1可知，在双层平板上肠出血性大肠杆菌噬菌体V_EcoM_C1均呈现出典型裂解性噬菌体特征，空斑透亮，无晕环，空斑边缘整齐清晰。由图2可知，噬菌体V_EcoM_C1头部椭圆形，长径约86 nm，横径约54 nm，具有可收缩性尾，尾长约76 nm，直径约10 nm。噬菌体V_EcoM_C1头部与尾部被颈圈隔开，具有可收缩肌鞘，按国际病毒分类委员会分类规则[15]，其属于尾噬菌体目肌尾病毒科。

2.2 噬菌体的宿主谱分析 将噬菌体V_EcoM_C1与不同种属标准菌株作用，结果发现，该噬菌体在4株非O157肠出血性大肠杆菌和2株O157肠出血性大肠杆菌平板上均能形成噬菌斑，说明噬菌体V_EcoM_C1可裂解5种不同血清型肠出血性大肠杆菌，且噬菌斑透亮，表明噬菌体V_EcoM_C1对ATCC 35150等5株菌具有较强的裂解作用（表1）。

图1 肠出血性大肠杆菌噬菌体V_EcoM_C1噬菌斑Fig.1 Plaques of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1

图2 肠出血性大肠杆菌噬菌体V_EcoM_C1的透射电镜观察Fig.2 Transmission electron micrographs of phage of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1

表1 噬菌体V_EcoM_C1噬菌谱Table 1 The host range of phage V_EcoM_C1

2.3 噬菌体的酸碱稳定性和热稳定性 由图3可知，噬菌体V_EcoM_C1在pH5～10范围内效价较稳定，但pH＜5以及＞10都会引起效价的明显减少，而当pH≤3或≥12时，才检测不到噬菌斑。由图4可知，噬菌体V_EcoM_C1在各温度下作用30、60 min后效价变化不大，说明在30～50℃下噬菌体V_EcoM_C1几乎维持在初始效价，但60℃时下降较快，且60 min组降低幅度大于30 min组，80℃之后已基本无噬菌体存在，表明高温会严重破坏噬菌体的活性。

图3 肠出血性大肠杆菌噬菌体V_EcoM_C1对酸碱的耐受能力Fig.3 Resistance of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1 to acid and alkali

图4 肠出血性大肠杆菌噬菌体V_EcoM_C1对温度的耐受能力Fig.4 Resistance of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1 to temperature

2.4 噬菌体的一步生长曲线 由图5可知，噬菌体V_EcoM_C1感染宿主菌的潜伏期约10 min，暴发持续时间约60 min，平均暴发量为26，具有较高的裂解活性。

图5 肠出血性大肠杆菌噬菌体V_EcoM_C1在37℃的LB培养液中的一步生长曲线Fig.5 One-step growth curves of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1 in LB at 37℃

2.5 噬菌体vB_EcoM_C1控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染 使用平板计数法检测料槽表面肠出血性大肠杆菌的数量，检测结果如图6所示，1 h后，料槽表面肠出血性大肠杆菌的数量降到103CFU/m2以下，5 h后，料槽表面肠出血性大肠杆菌的数量降到10 CFU/m2以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境（奶牛料槽表面）中的肠出血性大肠杆菌。

图6 肠出血性大肠杆菌噬菌体V_ EcoM_C1在养殖环境中裂解活性分析Fig.6 Lytic activity of Enterohemorrhagic Escherichia coli phage V_EcoM_C1

3 讨论

噬菌体作为一种能够高效裂解细菌的病毒，将有可能替代抗生素防治细菌性感染疾病。本研究从养殖场采集的污水样品中分离到宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌烈性噬菌体V_EcoM_C1，并对其进行了噬菌斑、噬菌谱、形态学（透射电镜）、遗传物质、酸碱及热稳定性、一步生长曲线等生物学特性及其控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌的污染的研究。结果表明：所分离得到的噬菌体V_EcoM_C1呈现出典型裂解性噬菌体特征，空斑透亮，无晕环；噬菌体V_EcoM_C1噬菌斑直径为1.0～1.5 mm；噬菌体V_EcoM_C1头部椭圆形，长径约86 nm，横径约54 nm；噬菌体V_EcoM_C1具有可收缩性尾，尾长约76 nm，直径约10 nm，头部与尾部被颈圈隔开；噬菌体V_EcoM_C1可裂解5种不同血清型肠出血性大肠杆菌，且噬菌斑都极其透亮，噬菌谱宽；在30～50℃保持高活性；在pH5～10稳定；噬菌体V_EcoM_C1感染宿主菌的潜伏期约10 min，暴发持续时间约60 min，平均暴发量为26，具有较高的裂解活性；控制养殖环境中的肠出血性大肠杆菌证明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境（奶牛料槽表面）中的肠出血性大肠杆菌，是1株宽噬菌谱肠出血性大肠杆菌烈性噬菌体。

青霉素类、头孢类和碳青霉烯类等β-内酰胺类药物是防治肠出血性大肠杆菌感染最主要的药物，其中青霉素类和头孢类药物在治疗肠出血性大肠杆菌感染中被广泛使用，但由于长期的药物选择性压力，病原菌表现出了对这些药物严重的耐药性。噬菌体是一种可杀灭细菌的病毒，噬菌体对宿主细菌的特异性高、强大的裂解能力以及对人类和动物（产品）没有毒副作用、不会产生药物残留等优势而显示出了比抗生素更加广阔的应用前景和价值[13-18]。噬菌体制剂的研制开发和应用无疑是解决这一问题的理想方法，在噬菌体产品开发方面，东欧一些国家已经批准某些噬菌体产品应用于人类皮肤金葡菌感染的治疗[19]，美国也批准某些产品应用于动物性食品的表面消毒，如2006年美国FDA批准李斯特噬菌体制剂在禽产品和芝士上[20]。噬菌体的裂解活性具有种属特异性和高裂解活性，通常可高效水解细菌细胞壁，为肠出血性大肠杆菌防控提供了新的思路。本研究已对分离纯化的肠出血性大肠杆菌噬菌体进行了生物学特性研究，后续将进行应用效果及安全性研究，以期为临床上研发治疗肠出血性大肠杆菌噬菌体制剂提供理论依据。