1株NADC30-like重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

邓紫艳，张 锋，董雅琴，吴发兴，段 纲，李晓成

（1.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；2.云南农业大学动物医学院，昆明 650201）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种严重危害全球养猪业的重要经济性传染病，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。PRRS的主要临床症状为母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道疾病[1]。该病于1987年在美国首次被报道，其后迅速传播至许多养猪国家。2006年，我国暴发的高致病性PRRS（Highly PRRS，HP-PRRS）给养猪业造成了巨大的经济损失[2]。由于PRRSV具有广泛的变异和毒株多样性，导致新毒株不断出现。2014年，我国出现了以NADC30-like为优势病毒株的流行病毒株，造成许多规模性猪场发生疫情[3]。PRRSV是有囊膜、单股正链RNA病毒。根据基因组核苷酸序列及抗原性差异，PRRSV分为2个基因型，欧洲型（1型），代表病毒株为Lelystab virus（LV），和北美洲型（2型），代表病毒株为VR2332[4]。PRRSV基因组全长约15 Kb，编码至少10个开放阅读框（open reading frame，ORF），主要包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～5、ORF5a和ORF6-7[5-6]。基因组5'端的ORF1a和ORF1b编码2个长的多聚蛋白pp1a和pp1ab。多聚蛋白被切割成至少12个非结构蛋白，在病毒的复制和免疫调控中发挥重要作用[7]。ORF2a、ORF2b、ORF3和ORF4分别编码病毒的次要结构蛋白GP2a、E、GP3和GP4，ORF5、ORF6和ORF7分别编码病毒的主要结构蛋白GP5、M和N，通过与宿主蛋白相互作用调控病毒转录[8-9]。病毒中和表位位于结构蛋白，可以诱导中和抗体的产生。我国猪场出现的NADC30-like病毒株，与HPPRRSV的Nsp2基因存在30个不连续氨基酸缺失不同，NADC30-like病毒株的Nsp2出现了131个不连续氨基酸缺失的分子特征。有研究表明，当前正在广泛使用的商业化疫苗对NADC30-like病毒株仅能提供有限的免疫保护作用[10]。为进一步了解山东地区NADC30-like PRRSV流行病毒株的遗传变异情况，本研究从山东威海某疑似PRRS发病规模化猪场发病死亡猪肺脏病料中分离获得1株PRRSV毒株，经全基因组测序鉴定和分析，该毒株为NADC30-like，将其命名为SDwh株。经生物信息学软件SimPlot分析发现，其基因组存在重组现象。本研究中对SDwh株遗传演化的分析新型重组病毒对于PRRSV监测和防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病料和主要试剂 病料采自山东省威海市某疑似暴发PRRS猪场送检的发病保育仔猪肺脏组织，置于-20℃冰箱冷藏备用。病毒DNA/RNA提取试剂盒和DH5α感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司；反转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂和dNTP购自Promega公司；DL2000 DNA marker、胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；KOD FX Neo高保真DNA聚合酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；pJET1.2/blunt Cloning Vector购自ThermoFisher公司；DMEM和胎牛血清购自Invitrogen公司；Marc-145细胞由中国动物卫生与流行病学中心畜病监测室保存。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank中VR2332、NADC30等PRRSV代表性毒株全基因组序列，设计了10对特异性引物用于扩增其全基因组序列（表1），引物由北京华大基因生物技术有限公司合成。

表1 PRRSV全基因组扩增用引物Table1 Primers used for amplification of PRRSV complete genome

1.3 病料样品处理 将采集的发病猪肺组织剪碎，匀浆研磨后用灭菌PBS按1∶5的比例稀释制成悬液，反复冻融3次，10 000×g离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜除菌，滤液保存于-80℃。

1.4 病毒分离培养和鉴定 Marc-145细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养传代，至6孔细胞培养板中长满单层时，接种含病毒的滤液200 μL，置于37℃、5%CO2细胞培养箱孵育1 h，弃上清液，加入2 mL含5%FBS的DMEM维持液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养3～5 d。每日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。如果出现CPE，取200 μL阳性培养物再传3代，至80%细胞出现CPE时收毒。取分离传代后的第3代病毒上清液提取核酸，进行常见猪源病毒（猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒和猪细小病毒）的特异性PCR鉴定。同时利用抗PRRSV N蛋白特异性单克隆抗体对分离病毒进行间接免疫荧光特异性鉴定。

1.5 全基因组扩增和测序 取收获的第3代上清液提取病毒RNA，使用随机引物反转录制备cDNA。PCR反应条件：94℃预变性2 min，98℃变性10 s、56℃退火30 s、68℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸7 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，按照胶回收试剂盒说明回收纯化后，连接至pJET1.2/blunt克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑菌鉴定后，送至北京华大基因生物技术有限公司测序。

1.6 全基因组序列比对与分析 利用Lasergene的SeqMan软件对全基因组序列进行拼接，用MegAlign与国内外分离毒株进行同源性比较。采用Mega 6.0软件进行序列分析，使用邻位相连法（Neighborjoining，NJ）构建遗传进化树。PRRSV代表毒株基因组序列均来自GenBank。

1.7 全基因组重组分析 利用SimPlot v3.5.1生物信息学软件，分析分离病毒株的重组情况，滑动窗口为500 bp，滑动步伐为20 bp。

2 结果

2.1 病料样品的RT-PCR检测 以提取的病料样品RNA为模板，使用PRRSV特异性引物ORF5F和ORF5R PCR扩增ORF5。结果显示，扩增出的目的片段大小为510 bp，与预期一致。

2.2 病毒分离培养和鉴定 病料接种Marc-145细胞，36 h后产生明显的CPE变化，细胞成灶状变圆突起、膨大，60 h后细胞皱缩、脱落（图1）。PCR鉴定结果显示，分离病毒中能够扩增出510 bp的PRRSV特异性目的片段，而其他常见猪源病毒检测结果均呈阴性。同时IFA检测结果显示，分离病毒感染Marc-145细胞中出现特异性的荧光（图2）。

图1 病毒在Marc-145细胞上的病变结果(200×)Fig.1 Cytopathic effect of virus in Marc-145 cell (200×)

图2 分离病毒IFA特异性鉴定Fig.2 Identification of isolated virus by immunofluorescence assay (IFA)

2.3 全基因组扩增和测定 利用10对特异性引物对分离病毒基因组进行分段扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测显示，扩增的10个片段大小与预期一致（图3）。扩增片段胶回收后，连接至pJET1.2/blun克隆载体上，由北京华大基因生物技术有限公司测序。利用SeqMan软件将测序结果拼接，获得PRRSV全基因组序列，长度为15 010 bp，命名为SDwh株。

图3 PRRSV全基因组扩增结果Fig.3 The whole genome amplification of PRRSV

2.4 SDwh全基因组同源性分析 将SDwh株与从GenBank中下载的国内外代表病毒株序列比对显示，SDwh株与北美病毒株NADC30的同源性最高，为93.1%；与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401、JL580的同源性分别为91.1%和88.4%；与我国HP-PRRSV JXA1、HuN4株及疫苗病毒株JXA1-P80同源性分别为85.3%、85.3%和85.2%；与北美代表病毒株VR2332、中国PRRSV经典病毒株CH-1a及疫苗病毒株CH-1R的同源性均为85.3%；与欧洲型代表病毒株Lelystad virus同源性最低，仅为60.6%。表明SDwh株与北美病毒株NADC30亲缘关系最近，与我国之前流行的HP-PRRSV和经典PRRSV亲缘关系较远。

2.5 SDwh株全基因组遗传演化分析 使用Mega 6.0软件构建遗传进化树，结果显示，PRRSV毒株分为两个群，以LV为代表的欧洲型和以VR2332为代表的美洲型。我国2型PRRSV又分为4个谱系（lineage 1、lineage 3、lineage 5和lineage 8），SDwh株与美国病毒株NADC30和中国的NADC30-like病毒株同属于lineage 1（图4）。表明SDwh株是北美病毒株NADC30进入我国后逐渐演化产生的新的病毒株。进一步分析发现，NADC30-like PRRSV亚群中病毒株又被分为不同分支，其中山东地区2016年分离病毒株SDYG1606和SDlz1601进化关系较近，2017年分离病毒株SD17-36和SD17-38进化关系较近，而SDwh毒株与上述病毒株进化关系较远。

2.6 SDwh株Nsp1、Nsp2和GP5氨基酸序列比对 将SDwh株与国内外PRRSV代表病毒株序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果显示，与其他病毒株相比，SDwh株与NADC30在Nsp2～ORF7编码区具有更高的相似性，分别为89.0%～97.9%和85.6%～100%；而在Nsp1编码区域，SDwh株与JXA1-P显示出更高的核苷酸和氨基酸同源性，分别为96.8%和95.6%（表2），提示该毒株可能存在重组现象。

图4 基于PRRSV全基因组的遗传演化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PRRSV whole genome

Nsp2氨基酸比对结果显示，与VR2332和CH-1a相比，SDwh株Nsp2具有不连续131个氨基酸的缺失，分别位于在322～432位（111个）、483位（1个）和504～522位（19个），同样的缺失情况出现于美国分离的病毒株NADC30和我国近年来流行的NADC30-like（如CHsx1401和JL580）中。同时在584～585位缺失2个氨基酸（图5A）。GP5氨基酸比对结果显示，与美洲型代表病毒株VR2332相比，SDwh株GP5在非中和表位1（27～30位氨基酸）存在V27A和A29V的突变，在非中和表位2（180～197位氨基酸）存在V185A、I189V、R191K和V192I的变异，非中和表位的突变与NADC30和NADC30-like病毒株JL580、CHsx1401相似。中和表位（37～45位氨基酸）无氨基酸突变（图5B）。表明SDwh Nsp2和GP5不仅具有NADC30-like病毒株的特征，还表现出新的氨基酸缺失变异。

2.7 SDwh株的重组分析 为了进一步分析SDwh株的重组情况，利用SimPlot生物信息学软件对分离病毒SDwh株基因组进行相似性比对分析，滑动窗口为500 bp，滑动步伐为20 bp。相似性图谱结果显示，SDwh株存在重组现象，重组位点位于Nsp2中（2066 nt），该断点将SDwh株基因组分为2个区域(A和B)，区域A与JXA1-P80亲缘关系最近，区域B与NADC30（2008年美国分离的2型PRRSV代表病毒株）亲缘关系最近（图6）。表明SDwh株是美国病毒株NADC30进入国内后与JXA1-P80重组产生的新型病毒。

表2 SDwh株与其他代表性毒株PRRSV基因组不同区域的核苷酸和氨基酸同源性比较Table 2 Nucleotide and amino acid identities of different regions of SDwh genome with other representative PRRSV strains

3 讨论

PRRSV作为一种迅速变异和演化的RNA病毒，其持续变异和毒株多样性加剧了该病预防和控制难度。自我国1996年首次分离到PRRSV毒株CH-1a以来，该病逐渐在猪场流行。2006年出现和流行的HP-PRRSV导致的疫情给我国养猪业造成了巨大的经济损失。近年来发现，NADC30-like新病毒株在我国流行，成为当前的优势流行病毒株之一。为了解山东地区PRRSV流行病毒株的遗传变异情况，本研究从山东省威海地区发病猪场采集阳性病料，并成功分离到PRRSV毒株SDwh。对该毒株进行全基因组测序和序列分析，结果显示，SDwh株与美国高毒力病毒株NADC30高度同源；与VR2332相比，SDwh Nsp2编码区存在131个氨基酸不连续缺失，GP5蛋白抗原表位存在6个位点的明显突变，符合NADC30-like PRRSV特有的氨基酸特征。同时SDwh株Nsp2在其他位置出现2个氨基酸的缺失，Nsp2氨基酸变化可能导致其抗原性发生改变。

依据SDwh全基因组核苷酸序列构建进化树，遗传演化分析表明，SDwh属于NADC30-like PRRSV亚群。进一步分析编码蛋白发现，SDwh Nsp1和JXA1-P80 Nsp1具有更高的氨基酸相似性，提示SDwh可能存在重组现象。有研究表明NADC30-like病毒株具有高致病性，易与我国已有的HP-PRRSV发生毒株间的重组，临床上正在使用的商业化疫苗对该类毒株缺乏免疫保护作用[10]。重组作为PRRSV遗传演化的一种模式，Li等[11]报道PRRSV毒株Em2007是田间流行株HP-PRRSV WUH1和疫苗病毒株CH-1R的重组病毒，动物实验显示，Em2007的致病性高于CH-1R亲本毒株CH-1a，表明重组在产生新毒株的同时，也存在致病性增强的情况发生。重组分析发现，SDwh可能是北美毒株NADC30和疫苗毒株JXA1-P80重组产生的新毒株，目前猪场使用的疫苗主要是经典PRRSV或HP-PRRSV传代致弱后的弱毒疫苗，与SDwh株的亲缘关系较远，因此不能为猪提供有效保护，导致猪场出现PRRSV感染发病情况发生。作为同期在PAM上分离的SD17-38毒株，其在Marc-145细胞未见明显CPE，动物实验显示其对猪具有高致病性[12]，而SDwh株可以同时在PAM和Marc-145细胞中产生明显细胞病变，推测SDwh株具有更强的适应能力，为其在猪群中的传播提供更有利的条件，导致该类型毒株在山东地区猪群中长期存在。

图5 PRRSV Nsp2（A）和GP5（B）氨基酸序列比对Fig.5 Sequence alignment of PRRSV Nsp2 (A) and GP5 (B) amino acid

图6 PRRSV SDwh株全基因组重组分析Fig.6 Recombination analysis of the whole genome of PRRSV SDwh strain

NADC30-like病毒株在我国的流行导致PRRSV的病毒株多样性增加，其变异速度快、易重组的特性，极易导致疫病的局部暴发和流行强度增强，从而增加疫情控制难度。新型PRRSV疫苗的开发变得尤为重要，通过对山东地区流行的NADC30-like病毒株的分离及遗传演化研究，为流行病毒株的重组特性分析以及新型PRRSV毒株疫苗的研制提供一定的数据支撑。