4株鸽源沙门氏菌致病性观察

张跃东，罗 薇，张焕容，任玉鹏，杨劲松，葛润洲

（西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041）

沙门氏菌可在人和动物间直接或间接传播[1]，造成局部或全身感染，引起胃肠炎、菌血症和肠外感染等疾病，是重要的肠道致病菌[2]。沙门氏菌血清型众多，目前已经确定的血清型有2600多种[3]，且在不断增加，其中有1600多种可引起温血动物感染[4]，包括我国发现的能引起禽类感染的38种血清型[5]。不同血清型的沙门氏菌致病特性不同。依据其对宿主适应性或嗜性，可将沙门氏菌分为高度适应性或专嗜性、非适应性或泛嗜性、偏嗜性三类。第一类沙门氏菌常见于鸡白痢、马牛流产等，给人或特定的动物造成特定的疾病；第二类沙门氏菌常见于肠炎和鼠伤寒，感染的宿主谱较为广泛，可使人和各种动物感染；第三类沙门氏菌常见于猪霍乱，在特定的宿主体内有较强的适应性，但也可以感染其他动物[6]。目前我国对沙门氏菌致病性的研究报道主要集中在家畜、家禽及人类食源中毒方面，关于鸽沙门氏菌的致病问题仅限于临床报告及其治疗用药方面。本研究于2016年3月至2017年5月对四川部分区域表观健康的赛鸽、信鸽进行了沙门氏菌携带情况的调查，发现调查区域沙门氏菌血清型众多、分布较广，以甲型副伤寒沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、伯里沙门氏菌、基桑加尼沙门氏菌4个血清型较多。其中甲型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi A）属于我国法定报告的乙类传染病之一，多呈散在发生、局部暴发或流行[7]。纽波特沙门氏菌（S.Newport）、伯里沙门氏菌（S.Bury）、基桑加尼沙门氏菌（S.Kisangani），相对比较少见，对于他们的研究多限于临床报告，而他们对禽类的致病性相关研究[8-9]却少见报道，尤其对伯里沙门氏菌的研究尚属空白。牛一般被认为是纽波特沙门氏菌的最适宜宿主，但也有家禽中发现纽波特沙门氏菌的报道，尤其是火鸡中[10-11]。纽波特沙门氏菌可以通过污染肉类食品、蔬菜、水果等，引起食物中毒。据报道，福建龙岩市数名参加婚宴村民出现纽波特沙门氏菌引起的食物中毒[8]。纽波特沙门氏菌可引起人类广泛的临床疾病，如腹泻、回盲部淋巴结炎、胸壁脓肿、输卵管积脓、骨髓炎、心内膜炎、脑膜炎、脾脓肿、败血症和菌血症等[12]。本研究拟以昆明鼠为实验动物，对鸽源纽波特沙门氏菌的致病性进行研究，以期了解其致病性，为鸽源沙门氏菌的基础生物学研究提供参考，具有公共卫生学意义。

1 材料与方法

1.1 菌株与实验动物 鸽源沙门氏菌菌株：甲型副伤寒沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、伯里沙门氏菌、基桑加尼沙门氏菌，于2016年3月至2017年5月分别采自四川省成都市及其周边地区部分赛鸽场30-50日龄的赛鸽，共计1357羽（羽色主要为灰羽、灰白条、雨点、雨白条、红棱等）；SPF级昆明鼠：18～20 g，雌性，购自成都达硕实验动物有限责任公司；实验鸽：30日龄，购自邛崃市某鸽场。实验动物购入后饲喂2 d，使其适应新环境。攻毒前对其粪便、饮用水、饲料、垫料及环境空气进行沙门氏菌阴性检测。

1.2 主要试剂及仪器设备 SC增菌液、SS琼脂培养基、TSB液体培养基、三糖铁琼脂（TSI）均购自杭州微生物试剂有限公司；科玛嘉沙门氏菌显色培养基购自博赛生物技术有限公司；沙门氏菌属多价诊断血清（A～F群）购自宁波天润生物药业有限公司；沙门氏菌属诊断血清抗O、H抗原单因子血清购自兰州生物制剂研究所有限责任公司；4%多聚甲醛通用型组织固定液购自成都鹏世达实验用品有限公司；预混酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司；37℃恒温震荡培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；Cary50紫外分光光度计购自Varian公司；ETC-811 PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司；普通PCR仪ETC811购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司；凝胶成像系统VersaDoc2000购自BIORAD。

1.3 沙门氏菌的分离鉴定 无菌采集鸽的肛拭子，置于SC增菌液，180 r/min、37℃恒温培养18 h，接种于SS培养基，37℃恒温培养18 h后，挑取SS培养基上无色或菌落中心有黑点的疑似菌落于沙门氏菌显色培养基纯培养后，挑取沙门氏菌显色培养基上单个紫色菌落于三糖铁琼脂斜面，37℃培养24 h，观察生化特性；按照诊断血清说明书，用玻片凝集法进行菌体血清型测定。根据GenBank中已公布的沙门氏菌菌属特异性invA基因的核苷酸序列，设计一对特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。以样本菌液为模板，PCR扩增目的片段。PCR体系为：模板DNA 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，预混酶12.5 μL，补足ddH2O至25 μL。PCR程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。同时将阳性PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 生长曲线测定 将待检菌落接种于TSB液体培养基中，37℃、150 r/min恒温振荡培养10 h后，取2 mL菌液接种于200 mL新鲜TSB液体培养基，37℃、150 r/min恒温振荡培养0～12 h，并每隔1 h吸取3 mL培养物，通过分光光度计测定600 nm条件下D值，同时取100 μL培养液，进行10倍梯度稀释，每个稀释度吸取100 μL均匀涂抹于SS培养基上，做3个重复，采用平板计数法测定不同培养时段的活菌数。绘制培养时间与D值的关系曲线，建立沙门氏菌的活菌数与D值的回归方程，继而得到D值为1时的活菌数。

1.5 LD50（media lethal dose）的测定及致病性观察 30只昆明鼠，每组5只，分为5组实验组，1组对照组。将待测沙门氏菌接种于TSB液体培养基中，37℃培养18 h，测定其D值，根据建立的沙门氏菌D值与活菌数的回归方程计算活菌浓度。将培养液进行10倍梯度稀释，调整至5个不同浓度（104～108CFU/mL），0.2 mL/只腹腔注射实验鼠，设置阴性对照，采用Reed-Muench法计算LD50。将实验鸽分为实验组、对照组2组，每组5只，攻毒前禁食12 h，选取对小鼠致病性较强的纽波特沙门氏菌菌株，以其100倍半数致死量的剂量通过口服途径感染实验鸽，观察纽波特沙门氏菌对实验鸽的致病情况。于感染后第7 d将实验组与对照组信鸽剖检，采集其脑组织、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠等组织器官，用4%多聚甲醛通用型组织固定液固定，24 h后更换一次新的固定液。切片制备、HE染色、病理组织观察由成都里来生物科技有限公司协助完成。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果 肛拭子样品经SC选择性增菌后，SS培养基有无色菌落，中心有些有黑色，圆珠状，边缘整齐，中等大小，在沙门氏菌显色培养基上呈淡紫色、边缘整齐、细小的菌株。分离菌株革兰氏染色镜检为革兰氏阴性短杆菌、大小均一、菌体多散在，与沙门氏菌特性一致。三糖铁实验结果显示，分离菌株有42株，呈现斜面为红、底部为黄的现象，部分底部出现黑色沉淀，符合沙门氏菌的三糖铁实验结果。三糖铁实验阳性结果的42株菌株能使沙门氏菌A～F多价血清凝集，共鉴定出沙门氏菌29个血清型，10株不能分型，其中甲型副伤寒沙门氏菌，纽波特沙门氏菌最多，各5株，其次为伯里沙门氏菌、基桑加尼沙门氏菌，各2株。选择沙门氏菌特异性引物invA-F/invA-R进行PCR鉴定，扩增出约722 bp的特异性条带，见图1。胶回收特异性条带并送测序，测序结果经NCBI中BLAST比对分析，确定为沙门氏菌特异性序列。

图1 部分被检菌株invA的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR results of virulence gene invA

2.2 生长曲线测定结果 4株不同血清型的鸽源沙门氏菌的生长曲线显示其生长特性相似，潜伏期约在2 h，对数增长期在2～11 h，11 h后是细菌的稳定期，其活菌数最高可以达到109CFU/mL。沙门氏菌D600值为1时，甲型副伤寒沙门氏菌、伯里沙门氏菌、基桑加尼沙门氏菌和纽波特沙门氏菌活菌数分别为9.42×108、2.5×107、2.68×109、5.87×108CFU/mL。4株不同血清型鸽源沙门氏菌菌株培养时间与D600值的关系曲线见图2。

图2 鸽源沙门氏菌菌株培养时间与D600值的关系曲线图Fig.2 The relation between cultured time and D600 value of Salmonella isolatated from pigeons

2.3 LD50及致病性观察结果 基桑加尼沙门氏菌LD50为3.58×107CFU，纽波特沙门氏菌LD50为2.49×107CFU，伯里沙门氏菌LD50为5.46×107CFU，甲型副伤寒沙门氏菌LD50为 3.73×106CFU。被感染鼠均表现有不同程度的扎堆、嗜睡、食量减少等症状，甲型副伤寒和纽波特沙门氏菌感染组有排稀粪现象；感染鼠的肝脏、脾脏肿大，充血、出血（图3A、3B）；肠壁变薄，肠腔内有黄色浆液性内容物（图3C、3D），实验结果提示感染菌对试验鼠有一定的致病性。选取致病性相对较强的纽波特沙门氏菌，以100倍LD50即2.49×109CFU/只，灌胃感染信鸽，观察纽波特沙门氏菌对鸽的致病性。结果显示，在感染后第2～5 d，实验鸽表现出精神萎靡、眼部肿胀、呼吸急促、粪便稀薄症状，在感染第6 d症状消失，第7 d进行病理解剖。感染鸽肝脏、肾脏轻微肿大，肺部局部充血，肠肿胀，肠壁变薄，肠内容内出现大量淡黄色分泌物。组织病理学检测表明，感染鸽的肝脏、肺脏、肾脏、胰腺有组织细胞减少，纤维素样变性及炎性细胞浸润等病变；回肠、空肠、盲肠的肠绒毛结构不完整、绒毛上皮脱落，绒毛及肌层有不同程度的炎细胞浸润。各脏器病理组织变化如下：肾动脉周围可见少量炎细胞浸润，动脉血管肌层肌纤维变性、排列紊乱（图4A）；肺脏局部组织结构破坏、部分肺泡塌陷，支气管平滑肌增生、肺泡腔内可见脱落的肺上皮细胞，肺血管变性、外膜层受损、结缔组织松散、周围散在的淋巴细胞浸润（图4B）；肝细胞分叶不明显，肝索排列紊乱，肝血管和肝窦内可见少量炎细胞浸润（图4C）；回肠、空肠、盲肠部分肠绒毛上皮脱落、结构不完整、绒毛及肌层可见不同程度的炎细胞浸润（图4D、4E）。胰腺胰管周围可见以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润（图4F）。

图3 鸽源沙门氏菌人工感染昆明鼠后病理变化Fig.3 Tissues and organs of mice typical pathological changes after Salmonella infection

3 讨论

细菌生长曲线的测定可用于准确计算、计数接种的有效病原量，是了解分离菌毒力、致病性的前提[13]。4株不同血清型的鸽源沙门氏菌的生长曲线显示其生长特性与其他报告的沙门氏菌生长特性相似[6,14-15]。通过对实验数据的分析，许多学者发现，D600值与细菌对数生长期的活菌数是呈正比例函数关系的，其相关系数为0.95～0.97。因此，用D600值取代活菌计数法，可用于细菌的定量，具有快速、简便、准确等特点，可简化后续研究中细菌计数的程序，为后续细菌毒力测定提供了便捷[6,15]。

图4 信鸽感染纽波特沙门氏菌后组织器官典型病理变化(100×)Fig.4 Typical pathological changes in tissues and organs of pigeon infected with S.Newport (100×)

衡量细菌毒力强弱，通常用半数致死量（LD50）来表达[16]。沙门氏菌血清型不同，其毒力情况也相差甚大。研究表明，沙门氏菌需较大剂量才可通过口服致病，且多数情况并不致死，因此，本研究选取了程琼等[17]对沙门氏菌研究方法，采用腹腔注射方式，对4株不同血清型鸽源沙门氏菌对昆明鼠的毒力进行了检测。结果显示：甲型副伤寒沙门氏菌毒力较强，LD50为3.37×106CFU；纽波特沙门氏菌、伯里沙门氏菌、基桑加尼沙门氏菌对昆明鼠的毒力相差不大，LD50分别为2.49×107、5.46×107、3.58×107CFU。实验鼠感染后，呈现出不同程度临床症状和病理损伤，损伤程度与接种剂量成正比。所有被感染鼠，均表现有不同程度的精神沉郁、扎堆、嗜睡、食量减少等症状，甲型副伤寒和纽波特沙门氏菌的中、高剂量感染组实验鼠有拉稀现象，且在48 h内全部死亡；感染鼠的肝脏、脾脏、小肠及肾脏，有明显的炎性病变，甚至坏死。纽波特沙门氏菌主要侵害信鸽的部位为肠道，还可引起肺脏、肾脏等实质器官的病变，从而影响其飞行能力。提示感染菌虽然源于外表健康的赛鸽、信鸽，但其仍有一定的毒力，亦可引起实验鼠致病乃至死亡。

沙门氏菌是重要的人畜共患病病原菌，沙门氏菌病受到全球公共卫生组织的关注[18]。非伤寒血清型的沙门氏菌感染也出现高致病率和死亡率，并导致巨大的经济损失。非伤寒沙门氏菌是食物中毒和肠道感染的主要原因，成为世界范围内重要的公共卫生问题[19]。据估计，非伤寒沙门氏菌血清型每年导致9380万人感染和155 000人死亡[20]。这些非伤寒沙门氏菌致病人数占食源性疾病总数的38%，其中由于食源性疾病造成了35%的住院和28%的死亡[20-21]。非伤寒沙门氏菌有广泛的储存宿主，并且分布极其广泛[22]，据报道在非伤寒血清型中，纽波特沙门氏菌是食源性感染的主要原因，由于食用受污染的食品而导致疾病暴发。在美国，每年因沙门氏菌感染造成的经济损失超过24亿美元[23]，其中由于纽波特沙门氏菌引发的食源性疾病排在前三位[24-25]。重要的是，纽波特沙门氏菌能够在粪便环境中长期生存，一旦误食粪便污染的食物可能会引起疾病[26]。纽波特沙门氏菌可以侵入植物组织，能够抵抗在食品加工过程中被清除，因此，沙门氏菌可以在各种环境中长期持续存在[27-29]。同时，纽波特沙门氏菌可以从多种细菌获得耐药质粒，从而在没有抗生素使用的情况下获得耐药性[30]，本研究所发现的四川地区鸽源纽波特沙门氏菌占据主要血清型且对信鸽肠道的侵害严重，然而纽波特沙门氏菌作为肠道菌，却也引起了鸽肺脏感染及气囊炎，致其飞行能力受到影响，相关致病机制有待进一步研究。本研究为后期鸽源纽波特沙门氏菌的防控及致病性研究提供了一定的理论参考。