基于Erns蛋白的猪非典型瘟病毒间接ELISA检测方法的建立

黎振标，任旭皎，刘健新，鲁 荣，李慧子，张彭涛，宁章勇

（华南农业大学兽医学院，广州 510642）

仔猪先天震颤（congenital tremor，CT）是由猪非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus，APPV）感染引起的病毒性疾病，发生该病的新生仔猪肌肉阵发性震颤，站立、行走困难，无法吮乳而死亡[1-4]，死亡率可达30%，其病理组织学变化特征为中枢神经髓鞘发育不全或缺失[5]。自2015年首次在美国发现APPV以来，中国、加拿大、德国、新西兰、西班牙、澳大利亚和巴西等世界上主要的养猪国家均发现了猪群APPV的感染和流行[2,5-9]。2016年，本实验室在我国猪群检测到APPV并分离获得了GD1、GD2和GD3毒株[7,10]。随后我国广西、江西、河北等地猪群中也检测到了该病原体在[8-9,11-13]。目前，APPV在中国呈流行加剧的趋势，造成了巨大的经济损失，严重影响了养猪业的健康发展。虽然本实验室在2017年已建立了基于E2基因的荧光定量RTPCR检测方法[10]，但是，到目前为止，APPV感染的血清学诊断方法缺乏，需要建立快速、准确的血清学诊断方法用于该病的综合防控。

APPV属黄病毒科瘟病毒属病毒，与其它瘟病毒在基因组编码蛋白上具有一定的相似性，均编码一个蛋白复合体。APPV病毒的基因组编码一个3635个氨基酸的蛋白复合体，该蛋白复合体由结构蛋白C、Erns、E1、E2和非结构蛋白Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B组成[10,14-15]。瘟病毒感染机体时，囊膜糖蛋白Erns首先介导病毒与细胞表面分子结合，随后E2与细胞表面受体特异性结合介导病毒的侵入[16]。在瘟病毒和机体互作的过程中，机体会产生针对E2、Erns及NS3蛋白的特异性抗体，其中E2蛋白由多聚蛋白的Arg690至Leu1060共370个氨基酸残基（Arg690～Leu1060）组成，位于病毒囊膜表面，参与病毒的感染过程[17]，囊膜糖蛋白E2（gp55）是一种重要的保护性抗原，具有高度的免疫原性，可以诱导机体产生高水平的中和抗体[18]；Erns蛋白诱导产生的中和抗体可以有效外抵抗病毒的攻击[19-21]。瘟病毒属病毒Erns蛋白的可变序列和保守序列存在于三个重叠抗原表位（AR1、AR2和AR3），依据这一特点可利用单个Erns抗原结构域或多个Erns抗原结合域进行病毒感染的血清学检测[22]。另外，编码Erns的核酸序列比编码E2的序列保守程度更高[23]，因此以Erns蛋白作为血清学检测的抗原更具特异性和准确性。

鉴于Erns蛋白在瘟病毒属病毒感染和致病中的作用和功能，在本研究中，我们以APPV的Erns蛋白作为靶标，制备了Erns重组蛋白，建立了间接ELISA检测方法并对临床样本进行了检测，为APPV的流行病学调查和临床诊断提供了有效的工具。

1 材料与方法

1.1 材料 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Ligation Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit、DL5000 DNA marker、大肠杆菌JM109感受态细胞、LATaqDNA聚合酶、Agarose Regular、RNase free water、IPTG、限制性内切酶（BamHⅠ，XhoⅠ）等均购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞、氨苄青霉素、溴化乙锭（EB）、TMB底物显色试剂盒、5×SDS-loading buffer、Prestained Protein marker、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG（H+L）等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；His标签单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG购自美国Jackson公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。猪非典型瘟病毒阳性血清样本、猪血清样本、APPV GD2株（GenBank登录号：KX950762）和pET-32a(+)载体均由华南农业大学病理教研室保存。猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及猪圆环病阳性血清由山东农业大学刘思当教授提供。

1.2 pET-32a(+)-APPV-Erns原核表达载体的构建 根据APPV GD2株的基因组设计Erns特异性扩增引物F1：5'-ATCATAGGATCCATGTTAGCAAGGTCC AGTG-3'（下划线表示BamHⅠ酶切位点）；R1：5'-TATAATCTCGAGTGGCG GCTTCAGCCACT-3'（下划线表示XhoⅠ酶切位点）。PCR扩增体系（25 μL），其中cDNA模板2 μL，dNTP Mixture 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL，LATaqDNA聚合酶0.2 μL，超纯水16.3 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，57℃退火35 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃再延伸10 min。回收PCR产物，利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对PCR回收产物和pET-32a(+)载体进行双酶切，回收酶切产物并连接，将重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞，然后进行阳性质粒筛选和鉴定，获得的阳性质粒命名为pET-32a(+)-APPV-Erns。

1.3 pET-32a(+)-APPV-Erns重组蛋白的诱导表达与纯化 pET-32a(+)-APPV-Erns表达菌接种至5 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇菌至D600约为0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37℃诱导6 h。收集细菌，500 μL PBS重悬细菌，300 w超声破碎10 min，加入5×SDS-loading buffer变性10 min后，SDS-PAGE电泳分析，筛选出pET-32a(+)-APPVErns表达菌的最佳诱导浓度、最佳温度及最佳时间。按照最佳诱导条件进行重组蛋白的大量诱导表达，离心收集细菌，用PBS缓冲液重悬后超声破碎，分离上清和沉淀，进行可溶性分析。包涵体蛋白用8 mol/L尿素溶解，低浓度梯度尿素复性后，按照His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，纯化的重组蛋白用His单克隆抗体鉴定。

1.4 间接ELISA检测抗Erns蛋白的血清抗体方法的建立

1.4.1 间接ELISA方法的建立 用0.5 mol/LNaCO3-NaHCO3包被液将Erns重组蛋白稀释至10 μg/mL，向酶标板加入100 μL蛋白稀释液，4℃包被过夜；弃包被液，加入300 μL PBST洗涤3次。加入100 μL的5%脱脂奶粉，37℃封闭2 h，300 μL PBST洗涤3次。加入100 μL待检猪血清，并设阴性对照组，37℃孵育2 h，洗涤3次。加入100 μL辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，37℃孵育1 h，洗涤3次；每孔加入100 μL显色液，常温避光孵育15 min后，每孔加入2 mmol/L H2S04溶液50 μL终止反应，在酶标仪450 nm紫外光下测量吸光度。

1.4.2 最佳抗原包被浓度及血清稀释浓度的确定 通过ELISA方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度。用抗原包被液将抗原浓度稀释至4、6、8、10、12 μg/mL，包被在酶标板上，每孔100 μL，重复3次，4℃过夜；300 μL PBST洗涤3次，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，300 μL PBST洗涤3次；将阳性血清进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释，每个稀释度重复3次。同上ELISA方法操作，测量样品D450平均值。最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度对应结果应为阳性血清的D450平均值接近1.0，P/N值最大。

1.4.3 阴阳性临界值的确定 利用已建立的ELISA方法检测20份仔猪的阴性血清，计算其D450的平均值（x）和标准差（s），根据公式计算阴阳性临界值（阴阳性临界值=x+3s）。

1.4.4 重复性检测 对血清样本进行重复性检验。将同一批重组蛋白包被在同一酶标板上，在同一酶标板内检测血清5份，每份血清重复3次，进行批内重复性检测；将同一批重组蛋白包被在3块酶标板上，在3块酶标板上分别检测5份血清，进行批间重复性检测。计算每份血清样本的平均值、标准差（s）和变异系数（CV）。变异系数=（标准差/平均数）×100%。

1.4.5 敏感性检验 选取一份阳性血清进行2倍倍比稀释，确定检测到阳性血清的最大血清稀释度，对血清样本进行敏感性检测，并设置阴性对照。

1.4.6 特异性检验 用已包被重组蛋白的酶标板在同一条件下对猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及猪圆环病毒病阳性血清进行特异性检测，检测该ELISA方法是否存在交叉反应。

1.5 临床样品的检测 应用本研究建立的间接ELISA方法对从广东省不同地区的收集的50份猪血清进行检测，计算血清样本的阳性率。

2 结果

2.1 pET-32a(+)-APPV-Erns原核表达载体的构建和鉴定 PCR扩增得到630 bp的单一条带，与目的基因大小相符；重组质粒pET-32a(+)-APPV-Erns经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，可见5900 bp和630 bp两条酶切片段（图1），将测序正确的重组质粒命名为pET-32a(+)-APPV-Erns。

图1 Erns基因的扩增及pET-32a(+)-APPV-Erns酶切鉴定Fig.1 Erns PCR products and pET-32a(+)-APPV-Erns products digested

2.2 重组蛋白诱导表达、可溶性分析和纯化 SDSPAGE电泳结果显示，在诱导温度为37℃，IPTG浓度为1 mmol/L，诱导时间为6 h时，在43.8 kDa处出现目的蛋白，而对照组pET-32a(+)空载和重组载体不诱导未见目的蛋白（图2A）。按照最佳诱导条件进行重组蛋白的大量诱导表达，菌液经过超声波破碎离心，上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明，上清中虽然有少量可溶性蛋白，但重组蛋白主要以包涵体形式表达（图2B）。重组蛋白纯化后，SDS-PAGE电泳检测表明，在43.8 kDa处出现单一条带（图3A）。用His单克隆抗体进行Western blot检测，结果表明Erns重组蛋白表达成功（图3B）。

2.3 ELISA检测抗Erns蛋白的血清抗体方法的建立

2.3.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释浓度的确定ELISA结果显示，抗原包被浓度为8 μg/mL，血清稀释度为1∶10，阳性血清D450值为1.37，阴性血清D450值为0.24，P/N值为5.71。此抗原包被浓度和血清稀释度下，阳性血清D450值最接近1.0，且P/N值最大，因此，最佳抗原包被浓度为8 μg/mL，最佳血清稀释度为1∶10（表1）。

2.3.2 阴性及阳性临界值的确定 结果显示，20份阴性血清D450平均值为0.18，标准差为0.046，阴阳性临界值为0.318。因此，待测血清D450＞0.318为阳性，待测血清D450≤0.318为阴性。

2.3.3 重复性检测 批内和批间的重复性检验显示，批内变异系数最大值为7.84%，批间变异系数最大值为8.57%，变异系数小于10%，说明该方法具有良好的可重复性（表2）。

2.3.4 敏感性检测 阳性血清稀释64倍时仍能检出，说明此检测方法具有良好的灵敏性。

图2 重组蛋白Erns的诱导表达（A）和可溶性SDS-PAGE分析（B）Fig.2 Analysis of the induced expression (A) and the solubility of Erns recombinant protein (B) by SDS-PAGE

图3 纯化重组蛋白Erns SDS-PAGE分析（A）及Western blot鉴定（B）Fig.3 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) analysis purified recombinant protein Erns

表1 抗原包被浓度和血清稀释度的确定Table 1 Determination of antigen concentration and serum concentration

表2 重复性检测Table 2 Repeatability test

2.4.5 特异性检测 利用该方法对猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及圆环病毒病阳性血清进行检验时，所有待检血清与APPV阴性血清的比值（P/N值）均小于2.1（表3），表明该方法具有很好的特异性。

表3 特异性检测Table 3 Specificity of detection

2.4.6 临床样品的检测 对从广东省不同地区收集的50份猪临床血清样本进行了检测，检出阳性血清5份，阴性血清45份，阳性率为10%。

3 讨论

研究表明，美国和德国猪群APPV感染率为2.4%～22%[24]，我国猪群的APPV感染率为1～20%[7,10]。此外，研究表明野猪群APPV感染率高，具有向猪群传播的风险[25]。APPV可存在性成熟猪的唾液和精液中，通过水平和垂直传播[26]。带毒成年猪无明显临床症状，新生仔猪一旦发病，只能淘汰[3-4]。因此，利用血清学检测方法判断猪群的感染状态是本病的防控的关键环节之一。建立血清学间接ELISA检测方法可尽早发现感染猪，并进行有效的淘汰。

利用大肠杆菌表达系统进行Erns蛋白原核表达抗原的制备，具有成本低、操作简便、适合大量制备等优势[27]。本试验利用pET-32a(+)原核表达系统成功表达了Erns融合蛋白，建立并优化了基于Erns蛋白的间接ELISA检测方法。通过对已知血清进行检测，确定了该ELISA检测方法的阴阳性临界值。该检测方法具有良好的重复性和特异性，批内批间的变异系数均小于10%，与猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及圆环病毒病阳性血清的阳性血清均不发生交叉反应。采用建立的ELISA方法对50份血清临床样本进行检测，其阳性率为10%。

综上所述，本试验利用Erns重组蛋白作为检测抗原，建立了基于Erns蛋白的间接ELISA方法，对从广东省不同地区采集的猪血清样品进行了检测，其阳性率为10%。该方法特异性和敏感性良好。本研究建立的间接ELISA检测方法特异性、敏感性和重复性好，为APPV流行病学调查及临床诊断提供了有效的工具。