猪圆环病毒2 型与3 型混合感染的PCR 检测

苏述色日

（四川省金阳县动物卫生监督所 四川凉山 610025）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）为迄今发现的最小动物病毒，根据基因型不同可分为PCV-1、PCV-2 和PCV-3[1]。 其 中PCV-1 对猪无致病性。PCV-2 具有致病性，是当前危害猪群的主要免疫抑制性疫病之一。PCV-3 为近几年新发现的病毒基因型，其致病性尚未明确，但在临床中繁殖障碍母猪和急性死亡仔猪体内可检测到PCV-3，推测PCV-3 可能引起与PCV-2 相似的临床症状[2]。2018 年12 月，某猪场发生了一起以母猪繁殖障碍，仔猪呼吸困难、咳喘、消瘦、腹泻、死亡，育肥猪渐进性消瘦为主要特征的疫病，经临床诊断初步怀疑为PCV 感染，为对此次疫病进行确诊，本文采集临床病料样品进行了PCR 检测。

1 材料与方法

1.1 临床病料样品的采集与处理

无菌采集病死猪的淋巴结、脾脏、肝脏、肾脏等病变组织，将其溶解于5 倍体积生理盐水中，经捣碎、碾磨、离心后，取上清液，-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

病毒基因组DNA 提取试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司；Taq 酶、dNTP 均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 引物设计与合成

参照杨永宁等[3]建立的PCV-2 和PCV-3 双重PCR鉴别检测方法分别设计合成PCV-2 检测引物（上游引物：5'-TGGCGGGAGGAGTAGTTT-3'； 下 游 引 物：5'-CCTCTCCCGCACCTT -3'） 和PCV-3 检 测 引 物（ 上游 引 物：5'-AAAGAGGCCAGCGAGTA-3'； 下 游 引 物：5'-CACTCCTCCGGTACAACA-3'）。该 方 法 可 对PCV-2 和PCV-3 分别扩增出片段大小约为300bp 和518bp 的特异性片段。

1.4 病毒基因组DNA 的提取

利用病毒基因组DNA 提取试剂盒提取处理后临床病料样品的基因组DNA。

1.5 PCR 扩增

以提取的临床病料样品基因组DNA 为模板，参照杨永宁等[3]的PCR 扩增方法进行PCR 扩增。PCR 扩增反应体系为：DNA 5μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、PCV-2 上游引物1μL、PCV-2 下游引物1μL、PCV-3 上游引物1μL、PCV-3 下游引物1μL、Taq 酶1μL、水31μL。PCR 反 应 程 序 为：95 ℃ 5min；95℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 40s，30 个循环；72℃ 10min；4℃终止反应。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

2 结果与分析

如图1 所示，临床病料样品经PCV-2 和PCV-3 双重PCR 鉴别检测方法可同时扩增出300bp和518bp左右的两条特异性片段，片段大小分别与杨永宁等[3]报道的PCV-2 和PCV-3 目的条带片段大小一致。表明临床病料样品经PCR 检测PCV-2 和PCV-3 均为阳性，该临床病例发生了PCV-2 和PCV-3 的混合感染。

3 讨论

由于现有的PCV-2 商品化疫苗对PCV-3 的保护性较差或无保护性，故准确的鉴别诊断致病原是PCV-2 还是PCV-3，对因地制宜的制定PCV 的防控措施至关重要。杨永宁等[3]建立的PCV-2 和PCV-3 双重PCR 鉴别检测方法在同一个PCR 反应体系中同时加入针对PCV-2 和PCV-3 的特异性引物，根据PCR扩增产物片段大小的不同，实现两种致病原的同时检测，具有简单、快速、准确、成本低等优点。鉴于此，本研究利用杨永宁等[3]建立的PCV-2 和PCV-3 双重PCR 鉴别检测方法对临床病料样品进行了PCR 检测，表明临床病例为PCV-2 和PCV-3 混合感染，说明PCV-3 不仅在猪群中广泛流行，且其存在与PCV-2 的双重感染现象，PCV-2 和PCV-3 的混合感染将大大增加PCV 的防控难度，造成的经济损失也更加严重，应引起高度重视。