鸡传染性贫血病毒VP3蛋白的原核表达及其单克隆抗体的研制

史静柯，王 鹏，霍臣智，宋 昊，杨海蓉，朱韩钰，许文琳，袁慧莎，叶建强,5，钱 琨，秦爱建，邵红霞

（1.扬州大学 教育部禽类预防医学重点实验室，扬州225009；2.扬州大学 江苏省动物预防医学重点实验室，扬州225009；3.扬州大学 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009；4.扬州大学兽医学院，扬州225009；5.扬州大学农业科技发展研究院，扬州225009）

鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）属于圆环病毒科环形病毒属。CIAV感染主要引起雏鸡生长迟缓，肌肉内和皮下出血，骨髓造血组织和淋巴组织萎缩，导致贫血和免疫抑制[1-5]。自1979年Yuasa等[2]首次报道以来，CIAV目前已在全球范围内流行，正危害国内外养鸡业健康持续发展[6-7]。由于骨髓造血细胞以及胸腺T细胞是CIAV感染靶细胞，CIAV感染被认为与鸡群对疫苗的免疫失败，继发感染，抗病毒、抗细菌能力下降直接有关，然而对CIAV致病分子机理知之甚少。CIAV是一种无包膜的二十面体单链DNA病毒，基因组全长约为2.3 kb，含有3个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码VP1、VP2和VP3种蛋白质。VP1是CIAV的衣壳蛋白[8]，具有较强免疫原性，可诱导机体产生病毒中和抗体。VP2是一种支架蛋白，可协助VP1蛋白形成正确构象，暴露VP1中和表位[9]。VP3是一种非结构蛋白，也称为凋亡素，VP3蛋白能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，被认为与CIAV感染引起的T细胞凋亡，淋巴组织萎缩，进而导致的免疫抑制密切相关。然而目前对VP3蛋白在CIAV感染，感染导致的免疫抑制及其诱导细胞凋亡的分子基础、信号通路及其关键分子均有待进一步挖掘。本研究通过一步克隆将CIAV的VP3基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1上，成功制备rGSTVP3融合蛋白的基础上，研制出抗VP3的特异性单克隆抗体，为进一步探究VP3在CIAV致病中作用及其诱导肿瘤凋亡机制提供了生物材料。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞以及质粒 CZC-1602-CIAV毒株、小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）、MSB1细胞、DF-1细胞、pGEX-6p-1原核表达载体、pcDNA3.1-VP3质粒由本实验室保存。

1.2 实验动物 6～7周龄的ICR和Balb/c小鼠均由扬州大学比较医学中心提供。

1.3 CIAV-VP3基因及pGEX-6p-1线性化载体PCR扩增

1.3.1 PCR引物设计 根据GenBank中已发表的鸡传染性贫血病毒的基因序列（GenBank登录号：M55918）设计并合成了一段针对CIAV-VP3的特异性引物，同时设计一段pGEX-6p-1载体线性化引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。CIAVVP3特异性引物，CIAV-VP3-F：5'-GTTCCAGG GGCCCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3'，CIAVVP3-R：5'-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTA TACACCTTC-3'；pGEX-6p-1载体线性化引物，pGEX-6p-1-F：5'-TAATGACGGTGAAAACCTCT GACACATGC-3'，pGEX-6p-1-R：5'-CATGGGCC CCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3'。

1.3.2 PCR扩增 CIAV-VP3的扩增：模板为本实验室分离的CIAV-CZC1602毒株，PCR扩增体系为：10×LaTaqPCR Buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTP mixture（2.5 mmol/L）2 μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板0.5 μL，LaTaq（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL；PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃再延伸10 min。

pGEX-6p-1载体线性化扩增：以pGEX-6p-1载体质粒作为模板，PCR扩增体系：10×LaTaqPCR Buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTP mixture（2.5 mmol/L）2 μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板0.5 μL，LaTaq（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL；PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火45 s；72℃延伸3 min，35个循环；72℃再延伸10 min。

1.4 pGEX-6p-1-VP3原核表达载体的构建 将PCR扩增得到的目的片段与pGEX-6p-1线性化载体回收后测定浓度，按CloneExpressTMⅡ One Step Cloning Kit说明书进行同源重组连接反应，然后转化DH5α感受态细胞。次日挑取单菌落进行PCR鉴定，挑选疑似阳性菌落提取质粒，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序验证。

1.5 pGEX-6p-1-VP3原核表达载体诱导表达及其纯化 将验证正确的含pGEX-6p-1-VP3重组质粒的BL21的阳性克隆，转接于LB培养基中，37℃、250 rpm振荡培养过夜。次日将重组菌按照1∶100（V/V）的比例接种到含Amp+（100 μg/mL）的2×YT液体培养基中，37℃、225 rpm振荡培养约2.5 h至D550达到0.6～1.0时，向菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，28℃、150 rpm，诱导培养5 h，同时设置pGEX-6P-1空载体细菌作对照。将诱导表达后的菌液6000×g离心10 min，弃上清液，收集细菌沉淀；用适量1×PBS将细菌重悬，6000×g离心10 min，弃去上清液，重复洗涤3次；随后在在冰浴上进行超声波裂解（Sonics，vibra cellTM），30 HZ裂解2 min每次间隔10 s，充分裂解诱导表达后的细菌，4℃条件下10 000×g离心10 min，分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。将细菌破碎后收集的重组蛋白用GE公司生产的GST-琼脂糖凝胶FF柱进行纯化，通过SDS-PAGE鉴定判断蛋白纯化效果，并将纯化获得的重组蛋白命名为rGST-VP3。

1.6 小鼠免疫及融合 将纯化后的rGST-VP3蛋白作为免疫原与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化后腹腔免疫6～7周龄Balb/c小鼠，50 μg/只。每次免疫间隔时间为10 d，三免后使用不加佐剂的100 μg rGST-VP3进行加强免疫，72～96 h之间按照常规融合方式进行细胞融合。

1.7 间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）筛选 取生长状态良好的DF-1细胞铺满96孔细胞板，次日待其长至约80%时，按照Trans IT转染试剂操作说明书，将 pcDNA3.1-VP3质粒转染至DF-1细胞。37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养24～72 h，然后用预冷的丙酮：乙醇（3∶2）固定液固定5 min，通风厨中吹干备用。首先用PBS洗3次，吸取100 μL杂交瘤上清液作为一抗，37℃孵育45 min，弃去杂交瘤上清液，并用PBS洗涤3次；加入1∶200倍稀释的FITC标记羊抗鼠IgG作为二抗，100 μL/孔，37℃避光孵育45 min，用PBS洗涤3次；洗涤后的板子内加入50%的甘油，50 μL/孔，置于荧光显微镜进行观察。以融合前的Balb/c小鼠血清为阳性对照，ICR小鼠血清为阴性对照。

1.8 单克隆抗体的亚类鉴定 按照Thermo公司的免疫球蛋白标准亚类快速鉴定试剂盒说明书，进行单克隆抗体的亚类鉴定。

1.9 Western blot验证 将纯化的rGST-VP3蛋白与5×蛋白上样缓冲液混合并煮沸5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗为阳性杂交瘤上清液，37℃孵育1 h，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，避光显色，用化学发光仪扫描结果并拍照保存。

2 结果

2.1 原核重组质粒 pGEX-6p-1-VP3鉴定 菌落PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后可以见到一条大小约366 bp条带（图1），与预计大小相符。测序结果进一步表明VP3基因已被插入到pGEX-6p-1表达载体中，方向正确且阅读框完整，无碱基突变。以上结果说明已成功构建VP3原核表达重组质粒pGEX-6p-1-VP3。

2.2 VP3重组蛋白的表达和纯化效果 将破碎后的重组菌上清和沉淀进行SDS-PAGE分析表明，在35 kDa左右出现特异性条带，而且目的条带主要存在于细菌破碎后的上清液中（图2）。Western blot结果显示，以病毒免疫小鼠血清做一抗，在35 kDa左右出现一条条带（图3），与预期结果相符。将诱导表达后细菌进行超声破碎后，上清液中菌体以GST-琼脂糖凝胶FF柱进行纯化，纯化效果较好（图4）。

图1 重组载体PCR鉴定Fig.1 PCR identification of recombinant vector

图2 诱导表达SDS-PAGE结果Fig.2 SDS-PAGE results of induced expression

图3 纯化后的重组蛋白rGST-VP3 SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE results of rGST-VP3 purified

图4 纯化的重组蛋白rGST-VP3的Western blot结果Fig.4 Western blot results of rGST-VP3 purified

2.3 抗VP3蛋白特异性单克隆抗体筛选及特性 以转染pcDNA3.1-VP3的DF-1细胞为抗原，通过IFA方法筛选出了2株与CIAV-VP3反应的阳性杂交瘤细胞株，分别挑取一个单克隆细胞建株命名为CIAVVP3-4G8和CIAV-VP3-4D7，具体IFA荧光结果如图5所示。将2株阳性杂交瘤细胞连续3次亚克隆，所有单克隆孔阳性率为100%。亚类鉴定发现，获得的两株单抗CIAV-VP3-4G8和CIAV-VP3-4D7重链均为IgG1，轻链均为Kappa。CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8的腹水间接免疫荧光效价分别为1∶102 400与1∶12 800。Western blot结果进一步证实，单克隆抗体CIAV-VP3-4D7和CIAV-VP3-4G8均能识别rGST-VP3（图6）。

3 讨论

图5 CIAV-VP3-4G8和CIAV-VP3-4D7间接免疫荧光结果Fig.5 IFA results of CIAV-VP3-4G8 and CIAV-VP3-4D7

鸡传染性贫血病毒的VP3通常被称为凋亡素，可选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，但不能诱导正常细胞的程序性死亡[10-12]。当正常细胞发生癌变，转化成肿瘤细胞时，凋亡素便可以选择性杀死肿瘤细胞。凋亡素是一种含有121个氨基酸的小蛋白质，分子量大小为13 kDa左右，编码基因ORF2位于CIAV基因组的486～849 nt，含有两个人富含脯氨酸的区域，一个疏水区域和两个带正电荷的区域[13]。有相关研究显示，凋亡素诱导的细胞凋亡过程不需要肿瘤抑制因子P53的参与，不但不能被原癌基因bc1-2的表达产物抑制反而能被其过表达所促进[14-15]。这些研究表明，凋亡素及其相关产品开发有望成为治疗肿瘤疾病有效药物。

目前国内外对于凋亡素的研究较多，但CIAVVP3单克隆抗体研制的报道较少。1990年，McNulty等[16]以纯化的CIAV作为免疫原，以间接免疫荧光的方式筛到能够分泌针对CIAV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2006年，陆桂丽等[17]利用His-VP3作为免疫原，并以包被His-VP3蛋白建立ELISA方法进行筛选，获得了抗VP3蛋白单克隆抗体。本研究采用的一步克隆法构建pGEX-6p-1-VP3重组表达载体，与传统方法相比极大的简化了实验操作过程。重组表达载体带有GST纯化标签，而且经过诱导表达后的目的条带主要以可溶性的形式存在，通过GST-FF琼脂糖凝胶柱成功对其进行了纯化，获得了大量的纯化蛋白。以构建的rGST-VP3重组蛋白作为免疫原，用转染VP3真核质粒的DF-1细胞作为检测原，通过IFA方法筛选抗VP3的单克隆抗体，确保了所获得单克隆抗体的特异性。获得的2株单克隆抗体CIAVVP3-4G8和CIAV-VP3-4D7不仅同时具有IFA以及Western blot反应性，而且能同时识别原核表达的VP3蛋白以及DF-1细胞中表达的VP3蛋白。抗VP3单克隆抗体CIAV-VP3-4G8和CIAV-VP3-4D7的研制，为进一步探究VP3在CIAV诱导免疫抑制中作用及VP3诱导肿瘤细胞凋亡分子机制提供了工具。单克隆抗体CIAV-VP3-4G8和CIAV-VP3-4D7识别表位鉴定及其它生物学特性研究也正在开展中。

图6 CIAV-VP3-4D7（A）和CIAV-VP3-4G8（B）Western blot 鉴定结果Fig.6 Western blot results of CAV-VP3-4D7(A) and CIAV-VP3-4G8(B)