前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞凋亡及周期的影响

祁雷磊，张丽娟，周冰莹，宋竖旗，卢建新，尹学来，庞 然

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，严重威胁患者健康。在世界范围内该病目前已经位居男性恶性肿瘤的第二位，并成为肿瘤所造成的男性死亡原因的第六位[1-2]。在中国前列腺癌的发病率和死亡率近年来均呈显著上升趋势[3]。随着药物研发和治疗理念的进展，对于前列腺癌目前具有许多新型药物和丰富的治疗手段。然而，无论是手术治疗，放、化疗，或是内分泌治疗均存在一定的治疗副反应，严重影响患者的生活质量[4-6]。中医药在肿瘤治疗中具有重要角色，前列消癥汤为中国中医科学院广安门医院刘猷枋教授治疗转移性前列腺癌的经验方，前期研究结果显示，该方不仅能够显著改善晚期前列腺癌患者的生活质量，还能够延缓去势抵抗性前列腺患者的临床进展[7-8]。现为进一步探索前列消癥汤治疗前列腺癌的疗效机制进行了以下研究。

1 材料与方法

1.1 细胞株 DU-145细胞，购于国家实验细胞资源中心，北京协和医学院基础所（STR信息：Amelogenin：X；CSF1PO：11；D13S317：11；D16S539：11；D18S51：14，15；D19S433：14；D21S11：29，31.2；D2S1338：18，20；D3S1358：16；D5S818：13；D7S820：8）。

1.2 主要实验试剂 凯基细胞DNA含量检测试剂盒购自中国凯基生物科技发展有限公司、Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司、MTT购置美国Sigma公司、磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）购自中国碧云天生物技术研究所、DMEM/F12培养基购自美国Hyclone公司、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）购自美国Hyclone公司、0.25%胰酶消化液+0.02%乙二胺四乙酸（Edetic acid disodium salt，EDTA）购自中国吉诺生物医药技术有限公司。

1.3 主要实验耗材及仪器 流式管购自美国 BD公司、Milli-Q Biocel超纯水系统购自法国Millipore公司、FACSCalibur流式细胞仪购置美国BD公司、2020冰点渗透压仪购自美国ADVANCED公司、PHS-2F酸度计购自中国上海雷磁仪器厂、DZF-6020真空干燥箱购自中国上海一恒科技有限公司、RE 52-05旋转蒸发器购自中国上海亚荣生化仪器厂。

1.4 药物制备 前列消癥汤（组方：黄芪20 g，生薏苡仁30 g，莪术10 g，土贝母10 g，猪苓10 g，白花蛇舌草20 g，黄精20 g）取上述中药剂量的4倍，一半置煎煮容器内，量筒量取10倍剂量的双蒸水浸泡半小时，然后煮沸，开小火熬2 h，过滤药渣倒出药液，然后将另一半中药用10倍量乙醇煎煮，煎沸2 h，过滤药渣倒出药液，合并2次滤液。将药液倒于旋转蒸发器瓶内，旋转蒸发制成膏剂，然后取出倒入盆内，置于真空干燥箱干燥48 h，进行真空干燥，然后将干燥的固体研磨成粉剂，用培养液分别配置成所需的浓度，低剂量组为10 mg·L-1，中剂量组为 30 mg·L-1，高剂量组为100 mg·L-1，用0.2 μm滤器过滤，分装至50 mL离心管中保存。然后测定最大浓度的前列消癥汤培养液的pH值及渗透压。

1.5 实验方法

1.5.1 流式细胞术检测前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞周期分布的影响 将处于快速生长期的DU-145细胞，更换培养液为高、中、低剂量含前列消癥汤药物培养液以及正常培养液作为对照，置于培养箱中生长24 h；24 h后取出各组细胞，经PBS润洗、胰酶消化、离心处理后的细胞重悬于预冷的PBS缓冲液中，计数并调整浓度为1×105个/mL；各组分别取1 mL细胞悬液至流式管，将各组流式管置于震荡器上部，然后在震荡的同时缓缓滴入预冷的无水乙醇3 mL，-20℃过夜以充分固定；取出固定于-20℃冰箱的各组细胞后，于低速离心机800 r/min离心5 min；各组加入100 μL RNase酶，然后放置在37℃水浴中孵育30 min；水浴后取出试管，在避光条件下，各管加入400μL试剂盒中 PI染色液，振荡器上摇匀后4℃避光孵育30 min；过目后，将上述样本于流式细胞仪上检测，记录激发波长488 nm处荧光值。

1.5.2 流式细胞术检测前列消癥汤对前列腺癌DU-145细胞凋亡的影响 将处于快速生长期的DU-145细胞，更换培养液为高、中、低剂量含前列消癥汤药物培养液以及正常培养液作为对照，置于培养箱中生长24 h；24 h后取出各组细胞，用预冷PBS润洗一遍，加入不含EDTA的酶消化液消化2 min，加入培养基（含10% FBS）1 mL以终止消化，吹匀后再次离心；向各组细胞中加入预冷1×Binding buffer （用超纯水将l0× Binding buffer稀释10倍）重悬，计数并调整细胞浓度为1×106个/mL，离心后，加入1mL 1×Binding buffer重悬，取l00μL细胞悬液至新流式管中。每个流式管中加入5μL AV避光孵育5 min，然后再分别向各流式管中加入5μL PI染色液，室温避光孵育10 min；孵育完成后，分别向各管中补充l×Binding buffer 300μL，振荡器上混匀避光保存，1 h内上流式细胞仪检测细胞调亡情况（上机前用300目过滤）。

1.6 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行数据的统计分析，结果以均数±标准差（）表示，计量资料采用单因素方差分析法（One-way ANOVA）。当方差分析结果存在显著性差异时，进一步进行两两比较，当同时满足正态性和方差齐性时，选用LSD-t法；同时满足正态性和方差不齐选用 Dunnett' s 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

MTT实验中的最大剂量1920μg/mL药液用酸度计及冰点渗透压仪器测定三次，取平均值，结果显示pH值为6.91±0.07，参考DMEM/F12（加入NaHCO2）说明书，在正常范围6.6～7.2。渗透压为：285.673±5.057，在正常范围渗透压274～302 mOsm/kgH2O 内。

MTT实验方法均显示前列消癥汤能够抑制DU-145细胞增殖，其IC50大约为830μg/mL，因此本研究中的中剂量浓度均采用此浓度，高浓度采用2倍IC50，大约为1 660μg/mL，低浓度采用1/2倍IC50，大约为415μg/mL。

2.1 前列消癥汤各剂量组对DU-145细胞凋亡影响 前列消癥汤低剂量组在早期凋亡、晚期凋亡方面与对照组比较，无统计学差异（P＞0.05）。中剂量组在早期凋亡、晚期凋亡方面显著高于对照组（P＜0.05）。此外，中剂量组早期+晚期凋亡与对照组相比，亦具有统计学差异（P＜0.01）。高剂量组在早期凋亡、晚期凋亡方面表现为进一步增加，与对照组比较，具有统计学差异（P＜0.01）。同时，高剂量组早期+晚期凋亡与对照组比较，也存在统计学差异（P＜0.01）。见图1、表1。

表1 不同浓度前列消癥汤对DU-145细胞凋亡的影响

图1 各剂量组前列消癥汤对DU-145细胞凋亡的影响

2.2 前列消癥汤各剂量组对DU-145细胞周期的影响 对照组与低剂量组的S期细胞比例分别为（31.69±1.29）%、（31.51±2.61）%，无统计学差异（P＞0.05）；对照组与中剂量组的S期细胞比例分别为（31.69±1.29）%、（37.96±2.24）%，两者差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组与高剂量组的S期细胞比例分别为（31.69±1.29）%、（43.77±2.48）%，两者差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图2、表 2。

表2 不同浓度前列消癥汤对DU-145细胞周期影响

图2 各剂量组前列消癥汤对DU-145细胞周期的影响

3 讨论

细胞凋亡也称为细胞程序性死亡，在1972年由Kerr、Wyllie和Currie三人首次提出。现已证实细胞凋亡在肿瘤的发生、发展以及转归中具有重要的作用。细胞凋亡是个复杂的过程，受多种基因、蛋白、受体、激素以及信号通路共同调节[9]。目前研究细胞凋亡主要通过以下2条途径实现：一条是通过死亡受体激活途径。在这一途径中，特异性配体FasL（CD95L）与Fas（CD95）结合后，可诱导细胞膜表面Fas分子聚集形成三聚体，启动Caspase的级联反应，从而降解胞内功能蛋白和结构蛋白，最终使靶细胞凋亡。另一条途径是线粒体-细胞色素C途径。当线粒体受到刺激后（如氧化剂、神经酰胺、钙离子、某些胱天酶、Bax等），可释放出细胞色素C，从而活化Apaf-1。活化的Apaf-1可通过与CARD-CARD的相互作用而活化Caspase，从而启动Caspase的级联反应[10]。

细胞增殖是由细胞周期调控系统控制和调节，细胞增殖周期分为DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）三个时期。恶性肿瘤具有的生物学特征之一是细胞周期调控紊乱，引起细胞恶性转变和肿瘤失控性增殖。细胞周期蛋白（Cyclins）、细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin dpendent kinases，CDKs）以及其相应的抑制分子细胞周期激酶抑制剂（cyclin kinase inhibitors，CKIs）共同组成了细胞周期调控系统，基因突变、细胞周期蛋白、激酶的失常或者相应的抑制分子突变均可使细跑周期调控系统失控而引起细胞恶性增殖而形成肿瘤。因此细胞周期的调控机制对于肿瘤的发生以及进展尤其重要，在肿瘤发生过程中，许多抑癌基因如p15、p16、p53、BRCA1、Rb以及 p53、BRCA1的下游调控基因如p21、Gadd45发生突变而失活[11]，造成细胞周期监测点功能缺陷，而引起细胞失控性增殖。

前列消癥汤是治疗转移性前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌的有效中药方剂，在中国中医科学院广安门医院泌尿外科临床应用十余年。在“积之成者，正气不足，而后邪气踞之”、“久病伤气”等中医理论的指导下，中国中西医结合泌尿外科奠基人刘猷枋教授通过不断的临床实践，运用宏观辨病和微观辨证相结合的思维方式，将转移性前列腺癌的核心病机概括为“正气不足、湿毒内蕴”，采用益气、解毒、利湿治法组方前列消癥汤。该方由薏苡仁、黄精、黄芪、白花蛇舌草、莪术、土贝母、猪苓组成。方中薏苡仁其味甘、淡，性微寒，归脾、胃、肺经，具有健脾利湿，舒筋除痹，清热排脓的功效，为方中之君药。现代药理研究证实其中所含薏苡仁多糖等成分不仅具有抗肿瘤活性，还具有免疫调节作用，能够调节免疫功能低下小鼠的胸腺指数，提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力[12]。黄芪与黄精两药益气滋阴，共为臣药，以助薏苡仁健脾益气之功。现代药理研究发现黄芪中所含的黄芪多糖不仅能够促进T淋巴细胞、树突状细胞及自然杀伤细胞的增殖，还能够通过靶向调控肿瘤微环境的细胞因子，从而达到诱导肿瘤细胞凋亡的作用[13]。而黄精内所含有的黄精多糖则能够抑制小鼠移植肿瘤Heps和Eac的生长，具有明确的抗肿瘤作用[14]。白花蛇舌草、土贝母、莪术、猪苓清热解毒，破血消积，共为佐药以祛邪。诸药合用，共奏健脾益气、解毒散结利湿之功，体现了中医治疗晚期肿瘤的扶正祛邪这一基本中医治则。前期研究证实，前列消癥汤能够显著抑制裸鼠前列腺癌移植肿瘤的生长[15]，抑制前列腺癌PC-3细胞及PC-3干细胞的增殖[16-17]，并能下调PI3K/Akt信号通路中Akt、mTOR和NF-κ B 表达，上调PTEN 表达[18]。

本实验结果说明前列消癥汤能够诱导前列腺癌DU-145细胞的早期及晚期凋亡，并随着剂量的增加，促进凋亡的作用似乎存在一定程度的增加。如果细胞生长被阻断在细胞周期的任何一个时期，则肿瘤细胞增殖过程将被阻碍，因而肿瘤的生长将被抑制。一种有效治疗肿瘤的筛选通常观察其抑制肿瘤的周期。从上述前列消癥汤对DU-145细胞周期影响的实验结果来看，前列消癥汤使DU-145细胞在G0/G1期的肿瘤细胞百分比下降，使S期肿瘤细胞百分比上升，G2/M 期肿瘤细胞百分比不变，说明前列消癥汤主要抑制前列腺癌DU-145细胞从 S期向G2期转变。