红藤汤对小鼠溃疡性结肠炎的保护作用及机制探究

刘丽华，曹泽伟

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的慢性非特异性肠道疾病，主要临床表现包括便血、腹痛和稀便等，且反复发作，容易癌变。近年UC发病率逐渐升高[1]，临床主要应用免疫抑制剂和激素类药物治疗，尚缺乏有效的治疗手段[2]。中医药治疗UC疗效确切，副作用少，复发率低，显示出了独特优势[3]。

根据UC各种的临床表现，中医可以把其归属于 “肠辟”和“痢疾”等范畴。病因主要包括脏腑功能失调，气滞血瘀，大肠湿热证、热毒炽盛证，并涉及气滞、瘀血、痰浊、寒湿、毒疫、伏毒、血热等。主要辨证治疗方法包括清热解毒和活血化瘀[4]。红藤汤加减方临床治疗UC效果显著[5]，但其作用机理尚未明确，故本文将从抗炎和抗氧化二个方面对红藤汤治疗UC的作用及其机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 药物制备 红藤汤药物组成：红藤30 g，败酱草30 g，蒲公英30 g，桃仁15 g，赤芍15 g，加8倍量水，煎煮2次，每次40 min，滤过，合并滤液，减压浓缩至60 mL。

1.2 实验动物与模型制备 本实验选择SPF级BALB/c雄性小鼠30只，6～8周，体重20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号： SCXK( 京) 2016-0011，于室温饲养一周后进行实验。采取随机数字表法分为3组(n=10)：对照组（C组）；模型组（M组）和红藤汤治疗组（H组）。参照文献方法[2]，M组和H组小鼠自由饮用4%葡聚糖硫酸钠（DSS）水溶液建立UC模型， C 组自由饮水，连续饮用10天。自造模第1天开始，H组给予红藤汤灌胃（15 mL/kg，1 次/d），连续给药10天；C组和M组以相同方式给予生理盐水。

1.3 标本的采集及结肠组织病理评分 所有小鼠于造模后第11天麻醉，取血置于促凝管中，于4 ℃，3000 rpm离心15 min，分离血清，置-80 ℃冰箱冷冻保存。采血后处死小鼠，取出整个结肠段，肛门至盲肠末端，用剪刀沿着肠系膜剪开整个肠腔，放到4 ℃生理盐水中，用棉签去除肠内容物，平铺整个肠段于玻璃皿中，进行大体观察损伤情况，剪取各组小鼠结肠病变较明显处的结肠组织，用4%的多聚甲醛溶液内固定，脱水、包埋和切片，并进行HE染色，用显微镜进行拍照，每张切片随机选取10个视野（×200），按照表1的标准进行组织病理学损伤评分。另剪取各组部分的病变组织，-80℃冰箱保存，用于组织中细胞因子含量及蛋白表达的测定。

表1 组织学评分标准

1.4 ELISA检测血清中炎症因子的含量 采取ELISA方法检测血清中TNF-α和IL-6炎症因子的浓度，按试剂盒说明书操作，酶标仪测定450 nm吸光度值，制作标准曲线并计算出小鼠血清TNF-α 和IL-6的含量。

1.5 比色法检测结肠组织MDA、SOD和GSHPx 取-80 ℃冰箱冷冻保存的结肠组织，制备10%的生理盐水组织匀浆液。利用分光光度计按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书操作，检测结肠组织中MDA的含量及SOD和GSH-Px的活力。

1.6 Western blotting 检测结肠组织中ERK1/2和JNK蛋白表达水平 取-80℃冰箱冷冻保存的结肠组织，利用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，离心取上清后进行蛋白定量和加热变性，取80 μg蛋白进行凝胶电泳，半干转转膜，一抗（稀释度1:1000）4℃冰箱过夜，TBST漂洗三遍后，加入二抗（稀释度1:5000）室温孵育1h，洗膜后加上化学发光液进行曝光，使用Quantity One凝胶成像仪进行扫描和分析。

1.7 统计学方法 实验数据的统计分析采用SPSS 18.0完成，所用数据均以均数±标准差表示，各组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红藤汤对UC小鼠组织病理学的影响 大体观察可见：C组小鼠结肠无损伤、出血、坏死和溃疡症状；M组小鼠结肠长度明显缩短，黏膜有溃疡形成；H组结肠长度缩短减轻，充血，溃疡程度较模型组有所改善。组织病理学损伤及评分如图1所示： C组无组织病理学损伤；M组黏膜肌层明显变薄，黏膜下层有大量炎症细胞浸润，组织病理学评分M组明显升高（P＜0.01）；H组炎症细胞浸润明显减少，黏膜结构完整，组织病理学损伤评分与M组对比显著降低（P＜0.05）。

图1 3组小鼠结肠组织病理学观察和评分 (HE 染色，x 200)

2.2 红藤汤对UC小鼠血清TNF-α和IL-6 含量的影响 如图2 所示，与C组相比，M组小鼠血清中 TNF-α和IL-6含量显著增加（P＜0.05）。与M组相比，H组小鼠血清中TNF-α和IL-6 含量显著减少（P＜0.05）。

图2 3组小鼠血清TNF-α和IL-6含量比较

2.3 红藤汤对UC小鼠结肠组织MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影响 如表2所示，与C组相比，M组小鼠结肠组织中MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.05），与M组相比，H组小鼠结肠组织中MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高（P＜0.05）。

2.4 红藤汤对UC小鼠结肠组织JNK和ERK1/2表达的影响 如图3所示，与C组相比，M组小鼠结肠组织中P-ERK1/2和P-JNK的表达水平显著升高（P＜0.05），与M组相比，H组小鼠结肠组织中P- ERK1/2和P-JNK的表达水平显著降低（P＜0.05）。

图3 3组小鼠结肠组织JNK和ERK1/2表达的变化

3 讨论

采用4%DSS诱导小鼠UC模型，其病理学改变和临床症状与人类相似，是目前最常用的方法[6]。本研究应用DSS制作UC模型，造模后10天，小鼠体重出现不同程度的降低，并出现稀便和便血等症状。病理学可见结肠长度明显缩短，黏膜损伤及炎症细胞浸润明显增加，提示DDS诱导的UC模型成功。给予红藤汤治疗后，临床症状和病理学改变都明显减轻，证实红藤汤对UC具有显著的治疗作用。

氧化应激是引起结肠炎症反应的潜在致病因素，这一点已得到充分证实[7]。中性粒细胞产生大量的活性氧（ROS）造成黏膜组织蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤。MDA是脂质氧化的标志物，高浓度的ROS可以攻击和灭活SOD和GSHPx，以及其他抗氧化酶，阻止ROS的清除[8]。本研究发现红藤汤有助于降低UC小鼠结肠组织中MDA含量，增加SOD和GSH-Px活性，提示红藤汤通过抗氧化作用保护UC损伤。

虽然UC发病机制尚未阐明，但抗炎细胞因子（IL-10）与促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）之间的不平衡在调节炎症反应中发挥着重要作用[9]。研究报道DSS诱导的小鼠结肠炎中促炎细胞因子IL-6和TNF-α水平都显著升高，并参与调节细胞凋亡和迁移及蛋白合成等信号通路[10-11]。TNF-α还能激活中性粒细胞，并导致肠黏膜的微循环障碍。IL-6活化STAT3信号通路，在UC发病过程中发挥重要的调控作用[12]。本结果显示，红藤汤治疗能降低UC小鼠血清中IL-6和TNF-α含量，提示红藤汤还可通过抗炎作用保护UC损伤。

已有研究证实，JNK和EKR信号通路调控炎症因子的表达和分泌[13]。抑制JNK和EKR信号分子的活化，可以显著降低IL-6和TNF-α炎症因子的分泌，减轻结肠损伤[14-15]。本实验结果表明DSS诱导的UC小鼠结肠组织中，JNK和ERK1/2蛋白的磷酸化水平都明显高于正常组，提示JNK和ERK1/2信号通路被活化，参与了 UC的发生和发展过程。红藤汤对UC 模型小鼠急性期JNK和ERK1/2信号通路都具有一定的抑制作用，这一结果提示红藤汤的保护作用可能是通过调节JNK和ERK1/2信号通路实现的。

综上所述，红藤汤可以减轻结肠脂质过氧化损伤、上调抗氧化酶及减少炎症因子释放，显著改善UC小鼠结肠组织的病理损伤和临床症状。其主要的作用机制可能与抑制JNK和ERK1/2信号通路有关。本研究为红藤汤的药理研究和临床应用提供一定的理论基础。