小鼠肺组织内质网线粒体结构偶联的分离与鉴定

董树安，余剑波，吴建华

内质网和线粒体之间的膜接触位点被称为内质网线粒体结构偶朕（Endoplasmic reticulum–mitochondria contacts，ERMC），是细胞内多种信号通路的共同结构平台，涉及参与调控Ca2+信号转导、细胞凋亡、线粒体形态、脂质代谢、炎性反应和自噬等[1]。研究发现ERMC是不同疾病发生发展的重要影响因素，因此分离ERMC对于研究其在疾病发生和发展中的作用有重要意义[2]。本研究主要探讨如何分离和鉴定肺组织内ERMC，从而为研究其在内毒素急性肺损伤中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验获得动物伦理批准（NKYY-DWLL-2019-027），取C57BL/6雄性小鼠(购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，合格证号： SCXK(军)2009-003）10只，周龄8～10周，体重25～30 g，于SPF屏障系统下，将小鼠每5只一笼分笼饲养于天津市中西医结合急腹症研究所动物房，适应性饲养一周，饲养室内温度控制在20～25 ℃，湿度控制在65%左右，保持小鼠昼夜节律规律，按时摄入食物及水分。

1.2 主要试剂及仪器 超速离心机，贝克曼超速离心机L-100XP，美国；电子分析天平，上海平轩科学仪器有限公司；兔抗三磷酸肌醇受体-Ⅰ（IP3R-1）抗体、兔抗Sigma-1受体分子伴侣（Sig-1R）抗体、鼠抗蛋白质二硫键异构酶（PDI）抗体、鼠抗Cyto C抗体、鼠抗钙连蛋白抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；二抗购自天津三箭生物技术有限公司。

1.3 小鼠肺组织内ERMC的分离过程 由于肺组织线粒体提取较为困难，且与其他组织细胞相比，内质网含量较少。既往Wieckowski等[3]方法是针对肝脏实体器官的分离提取，因此，在分离肺组织ERMC的过程中，本实验在预实验结果不理想的基础上做了相应的修改，具体操步骤见图1。

图1 小鼠组织内ERMC的提取分离和纯化流程图

1.3.1 组织提取 调整细胞悬液离心条件，将准备好的肺组织细胞悬液在4 ℃以600 ×g离心10 min。收集上清液，沉淀弃去。收集上清液，将其离心条件调整为4℃以11 000×g离心10 min。离心后得到的上清液中含有细胞浆蛋白，沉淀中含有线粒体。进一步分离内质网，调整离心条件为4℃20 000×g离心30 min，离心结束后沉淀即为膜蛋白，此步分离所得上清继续在4℃ 100 000×g离心60 min，最后这一步所得沉淀即为内质网。将线粒体重悬在预冷的MRB溶液中。

1.3.2 ERMC的纯化 在15 mL离心管中加入8 mL percoll溶液，液面上加入提取好的粗提线粒体溶液2 mL，再加入3.5 mL MRB溶液，保持液面距离管口4～5 mm。将上述混合溶液的离心条件调整为4 ℃ 100 000 ×g离心30 min。离心结束后，离心管中间有一层白色条带层，其内含有ERMC，离心管底部沉淀含有纯化的线粒体。分别用胶头滴管小心吸取含有ERMC层溶液，向其中加入10倍体积的线粒体溶解溶液；此外，用另一胶头滴管吸取含有线粒体层溶液，加入10倍体积的线粒体溶解溶液，调整离心条件为4 ℃ 100 000×g，将含纯化线粒体的溶液离心30 min，沉淀内含有纯化线粒体。此外，为进一步纯化线粒体，可继续用20 mL线粒体溶解溶液重悬，继续在4 ℃10 000×g离心10 min，沉淀可用线粒体溶解液溶解。对于ERMC的纯化，离心结束后将ERMC上清液取出，在4 ℃100 000×g离心60 min，沉淀即为纯化ERMC，可用线粒体溶解液溶解。

1.4 鉴定提取分离的ERMC 将上述分离得到的粗体线粒体、内质网、纯线粒体、ERMC各细胞内亚结构进行Western blotting。采用BCA法对上述细胞器结构进行总蛋白测定，具体结果见表1。向每个加样孔加入的蛋白质量（蛋白质混合物）为40 µg，进行免疫印迹检测，阳性条带以Quantity One 4.62凝胶光密度分析软件进行分析，测其累积光密度参考值（Integrated optical density，IOD），以各细胞器内不同蛋白的表达程度与其在线粒体或内质网内相应蛋白的比值表示。

表1 肺组织内各细胞亚结构的蛋白含量 （μg/μL）

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism8.0软件处理数据，计数资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

小鼠肺脏细胞内ERMC提取分离的结果见图2A，中间一层白色条带中含有ERMC，底层白色沉淀物为纯化的线粒体。

对分离纯化的ERMC和其他组分进行鉴别，结果发现PDI主要表达在内质网和ERMC中，在纯化线粒体中几乎不表达，细胞色素酶C表达于线粒体中，因此在纯化线粒体和粗提线粒体内其表达量较大；而钙连蛋白主要表达在内质网中，在线粒体内表达量较低。IP3R-1作为内质网上的钙离子通道，在内质网和ERMC均有表达，而在纯化线粒体中几乎不表达；此外，Sig-1R多表达在ERMC和线粒体中，在内质网中几乎不表达（图2B、表 2）。

图2 小鼠肺组织ERMC分离和鉴定结果

表2 细胞内不同细胞器中不同蛋白分子表达情况的比较（n=10）

3 讨论

1958年，Copeland等[4]首次描述内质网和线粒体之间存在联系密切。随后，到70年代早期，越来越多的研究人员在大鼠肝细胞中观察到线粒体外膜和内质网之间连接紧密，但并未对其进行命名[5-6]，直到20年后，Vance等[7]首次成功分离了ERMC结构并对其特点进行了分析。研究者们通过免疫印迹法发现ERMC、线粒体和内质网三者之间的蛋白谱组成存在着明显的差异性，但又有一定的相似性[1]。

ERMC中的蛋白分子能使内质网和线粒体选择性地释放和吸收Ca2+[8]。内质网上的IP3R能够与线粒体上的低亲和力Ca2+转运通道（Voltagedependent anion channel 1，VDAC1）组成 Ca2+转移通道，使钙离子由内质网转移至线粒体[6]。因此，当细胞受到刺激后，线粒体内Ca2+浓度会明显高于细胞质[8]。目前研究发现，多种蛋白分子参与线粒体和内质网之间的相互作用，提示ERMC在生物能量学、细胞存活和细胞死亡中发挥重要作用[9]。目前，IP3R及线粒体外膜上与其联系紧密的VDAC是近年来研究的热点，IP3R-VDAC复合物的装配过程往往需要多种分子伴侣参与[10-11]。Sig-1R在ERMC中富集，从而招募Ca2+结合分子GRP78、锚蛋白B和IP3R-3[12]。此外，葡萄糖调节蛋白75(GRP75)是联系IP3R和VDAC之间的重要桥梁蛋白分子[10-11]。在ERMC中还发现了内质网上的能够与Ca2+结合的分子伴侣，如钙连蛋白、钙网织蛋白和内质网蛋白44（Endoplasmic reticulum resident protein 44，ERp44） 等[10-11]。PACS-2也是ERMC中的重要组成分子[10-11]。除此之外，ERMC中还包括与线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）功能类似的有腺嘌呤核苷酸转位酶（Adenine nucleotide translocase，ANT）和环磷酰胺D，进而使线粒体对Ca2+信号更加敏感[13]。

为研究ERMC在内毒素急性肺损伤小鼠发病机制中的作用，本研究首先成功分离肺组织细胞内的ERMC，为了验证分离方法的可行性，在预实验中，笔者按照Wieckowski等[3]的方法选取0.5 g肺组织，但是在验证ERMC组成的环节上，本研究发现肺组织中提取的蛋白质浓度较少，不能用于后续的蛋白鉴定过程。因此，为了更好的分离和提纯肺组织中的ERMC，本研究称取的肺组织提高为1 g，按照试验流程对ERMC提取和纯化后，经BCA法测定肺组织和肝组织不同组分的蛋白浓度，结果提示蛋白浓度可用于后续的Western blotting检测。而Wieckowski等[3]的方法主要针对肝脏实体脏器进行分离，0.5 g肝组织所提取的蛋白能够用于后续的蛋白鉴定过程，可能与肝组织质地均匀，能够提取出较多蛋白有关。

通过Western blotting检测发现，本研究采用的分离提纯ERMC方法合理可靠，能够有效分离不同组织细胞中的ERMC；然后对分离纯化的ERMC和其他组分进行鉴别，笔者发现PDI平均分布在内质网和ERMC，Cyto C主要集中在线粒体内，而钙连蛋白主要集中在内质网内，IP3R-1作为内质网上的钙离子通道，在内质网和ERMC中均有表达，此外Sig-1R多集中于ERMC和线粒体中，上述蛋白表达趋势符合ERMC中相应蛋白分布特征。为进一步探讨ERMC在内毒素所致急性肺损伤过程中的变化提供了技术支持。