洋川芎内酯A对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的作用及机制研究

郑 雷，陈 翔，尹博炜，陈大可，胡明哲

关键字：洋川芎内酯A；单侧输尿管梗阻；肾间质纤维化；Wnt4/β-catenin信号通路

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是导致终末期肾功能衰竭的主要因素，随着生活方式改变，其发病率也随之逐年上升，已成为世界范围内的公共健康问题[1]。据调查，我国CKD发病率已高达10.8%，患者数量约1亿例，而大量CKD患者可发展为终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）[2]，严重威胁生命健康。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各类病因所致慢性肾脏病的共同病理过程，主要表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肾间质内过度沉积以及肾间质内成纤维细胞异常增生，继而破坏肾脏结构，扰乱肾脏功能[3-4]，因此RIF是CKD病理进程及预后途径中的关键靶标，对于CKD的病理转归具有重要意义。由于RIF病理机制复杂，近年来与RIF治疗相关的病理探索和药物开发成为研究热点。

目前，临床中尚无治疗肾纤维化的有效药物，而传统中草药在肾纤维化的预防及治疗方面发挥积极作用[5]。川芎属伞形科植物川芎（Ligusticum Chuanxiong Hort）的干燥根茎，最早记载于《神农本草经》，其性温味辛微苦，归肝、胆、心包经，具有活血化瘀、行气解郁等功效。现代研究发现，川芎具有抗炎、抗氧化及神经保护等作用，对心血管系统、呼吸系统及泌尿系统均表现出良好的保护能力，尤其在对肾病的防治方面具有重要意义[6-7]。洋川芎内酯A（Senkyunolide A，SenA）是川芎中重要的苯酞类物质[8]，入血后在体内分布良好，具有显著的抗氧化损伤、舒张血管等作用[9]，而其对慢性肾脏病的治疗是否具有同样的可靠价值尚不明确。因此本研究拟通过单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)建立大鼠RIF模型，并给予SenA进行干预治疗。采用病理学观察及生物分子学检测，探讨SenA改善RIF的作用及机制，为RIF治疗提供新的策略，同时为川芎的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康雄性SD大鼠50只，体质量180～220 g，购自南京青龙山动物养殖场，合格证号：SCXK(苏)2017-0001。饲养于SPF级动物实验室，给予标准普通饲料，自由饮水，适应性喂养3天后用于后续实验。

1.2 主要试剂及仪器 SenA（HPLC≥98%，Y-083）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；厄贝沙坦（HPLC≥98%，37655）购自赛诺菲杭州制药有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂，北京中杉金桥生物技术有限公司；HE试剂盒、RIPA裂解缓冲液，北京索莱宝科技有限公司；ECL试剂盒，美国Santa Cruz公司；α-SMA及Collagen I一抗，美国Santa Cruz公司；GAPDH及二抗，上海碧云天生物技术有限公司；E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Wnt4、β-catenin、GSK-3β 及p-GSK-3β一抗，美国CST公司。1/10万电子天平，日本岛津公司；CK2显微镜，日本OLYMPUS公司；AU5800全自动生化分析仪，美国Beckman公司；电泳仪、凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；其他试剂均购自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 模型制备与分组 将大鼠随机分为假手术组、模型组、SenA低剂量（20 mg/kg）组、SenA高剂量（40 mg/kg）组及阳性对照（厄贝沙坦，20 mg/kg）组。除假手术组外，其余各组大鼠按5 mL/kg给予8%水合氯醛进行麻醉，在剑突下侧4 cm处切开，钝性分离皮层与肌层，暴露肾下极并游离左侧输尿管，托住输尿管中上段，采用4-0号丝线在相距1 cm处对输尿管两侧进行结扎，在结扎中间部位剪断输尿管，缝合开口。假手术组处理同上，但不行结扎手术。造模后，各组大鼠灌胃给予相应剂量药物，假手术组与模型组大鼠给予等量生理盐水，连续给药21天[10]。

1.4 标本收集与固定 大鼠末次给药24 h后，眼眶取血，分离血清。根据试剂盒说明书操作步骤检测血清中Scr及BUN水平。取部分左侧肾脏，固定于4%多聚甲醛中，4℃条件静置2天，用于后续HE染色及免疫组化实验。剩余部分置于-80℃冰箱用于后续Western blotting试验。

1.5 HE染色 取出固定好的肾脏组织，经过常规脱水、透明、浸蜡与包埋等步骤，切成4 μm薄片。随后对其进行HE染色，中性树胶封片，置于显微镜下进行观察、拍摄。

1.6 免疫组化 将石蜡切片后经脱蜡水化，加入3% H2O2孵育10 min，随后采用热抗原修复、5%BSA封闭、一抗（1:500）4℃孵育过夜、二抗常温孵育30 min、DAB显色。通过水洗、复染、脱水、透明与封片，置入显微镜下进行观察、拍摄。观察指标：蛋白阳性表达呈黄至棕黄色颗粒，主要定位于细胞浆。同时用IPP6.0软件对图像进行光密度分析。

1.7 Western blotting检测上皮细胞-间充质转化（EMT）相关蛋白表达水平 取部分肾脏组织，加入裂解缓冲液提取蛋白。采用BCA法对蛋白浓度进行分析计算。随后在蛋白样品中加入上样缓冲液孵育，取蛋白样本通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行分离，再由半干转膜法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜。加入5% BSA封闭1h，滴加一抗（1:1000）-4℃孵育过夜。次日滴加二抗常温孵育30 min，随后加入ECL液显影成像。通过Image J影像分析系统计算各组蛋白表达水平，采用β-Tubulin作为内参。

1.8 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行处理。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中肾损伤标志物水平的比较 模型组大鼠血清中BUN及Scr水平高于假手术组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型大鼠比较，SenA低剂量组、SenA高剂量组及阳性对照组大鼠血清中BUN、Scr水平均明显降低，其中SenA高剂量组及阳性对照组降低效果更明显（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠肾脏病理学观察的比较 假手术组大鼠肾脏内部未见明显病变，肾小管大小、形态均正常。肾小管间质未见增宽、充血或炎性细胞浸润等。模型组大鼠肾脏中可见严重的肾小管扩张、小管萎缩、上皮细胞空泡变性；同时出现明显的肾小管间质增宽、间质内单核/巨噬细胞等炎症细胞浸润增多，纤维组织增生等现象。与模型组大鼠比较，SenA低剂量、高剂量及阳性对照组大鼠的肾间质损伤均有不同程度减轻，偶见炎性细胞轻度浸润、纤维组织轻微增生等现象，其中以SenA低剂量组效果最佳。见图1。

2.3 各组大鼠肾组织中Wnt4/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的比较 与假手术大鼠比较，模型组大鼠肾组织中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin表达上调（P＜0.01）。与模型组大鼠比较，SenA低、高剂量及阳性对照组大鼠肾组织中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin水平明显降低，以SenA高剂量及阳性对照组效果最优（P＜0.01），见表2，图2。

图1 各组大鼠肾脏组织病理学观察（HE染色）

表2 各组大鼠肾组织中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin表达水平的变化

图2 各组大鼠肾组织中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin表达情况

2.4 各组大鼠肾组织中EMT相关蛋白表达水平的比较 与假手术大鼠比较，模型组大鼠肾组织中E-cadherin表 达 下 调，Vimentin、α-SMA及Collagen I表达上调，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，SenA低、高剂量及阳性对照组大鼠肾组织中E-cadherin水平明显升高，其中SenA高剂量及阳性对照组效果最优（P＜0.01）；与模型组比较，SenA低、高剂量及阳性组大鼠肾组织中Vimentin水平明显下降，其中阳性对照组效果最优（P＜0.01）；与模型组比较，SenA低、高剂量及阳性对照组大鼠肾组织中α-SMA水平明显下调，其中SenA高剂量组效果最优（P＜ 0.01）；与模型组比较，SenA低、高剂量及阳性对照组大鼠肾组织中Collagen I水平明显下调，其中SenA高剂量及阳性对照组效果最优（P＜ 0.01）。见表3，图3。

表3 各组大鼠肾组织中EMT相关蛋白表达水平的变化

图3 各组大鼠肾组织中EMT相关蛋白表达情况

2.5 各组大鼠肾脏中α-SMA阳性染色水平的比较 模型组大鼠肾组织α-SMA阳性率高于假手术大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型大鼠比较，SenA低、SenA高剂量及阳性对照组大鼠肾组织α-SMA阳性率明显降低，其中SenA高剂量及阳性对照组效果最为明显（P＜0.01）。见表4、图4。

表4 各组大鼠肾脏中α-SMA阳性率比较

图4 各组大鼠肾组织免疫组化染色

3 讨论

肾间质纤维化是慢性肾脏病发展至终末期肾功能衰竭的病理基础，其病理进程主要表现为肾小管萎缩、管周毛细血管丧失、炎症反应、细胞外基质沉积等[11]。通常RIF是由各类细胞因子及信号通路共同参与调控的病理过程，目前其发病机制尚未明确，临床上尚无有效的干预手段治疗RIF[12]。中医认为，肾纤维化属“关格”“水肿”“虚劳”“腰痛”“癃闭”等范畴，本虚标实为其病机，主要以脾肾气虚、肾阳衰败为本，湿浊、瘀毒为标，临床常用行气解郁、活血化瘀的川芎进行组方对RIF进行治疗[13]。SenA是川芎中的重要成分，研究显示其具有良好的抗氧化、抗炎、抗血小板聚集及舒张血管等作用[9]，与此同时UUO作为经典的RIF动物造模方式，广泛被应用在RIF的实验研究[14]。本研究通过UUO手术建立RIF模型，用以探讨SenA是否参与了川芎抗RIF的干预过程。病理形态考察显示，SenA可有效缓解UUO模型大鼠的肾间质纤维化病变。而BUN、Scr通常作为评估药物对UUO模型大鼠肾损伤的金指标[15]，结果显示，SenA可明显降低RIF大鼠血清中BUN、Scr含量，提示其具有良好的改善肾损伤作用。初步揭示了SenA逆转肾间质纤维化、改善肾损伤，继而发挥保护肾脏的作用。

近年来，随着器官纤维化研究的逐渐深入，EMT机制受到日益关注，EMT进程在肾间质纤维化病变中扮演着关键角色[16]。通常EMT发生后可诱导细胞内上皮表型特征标志物（E-cadherin）的合成减少，继而使其极性降低、黏附性减弱等；细胞内间充质表型特征标志物（Vimentin、α-SMA）的合成增加、Collagen I的分泌亦随之上调[17]。研究表明，Vimentin、α-SMA作为重要的细胞骨架蛋白，分别为肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化时的中间产物，以及平滑肌细胞的标志物，而Collagen I通常为UUO诱导沉积于肾脏间质及血管周围的主要胶原，由肾间质中肌成纤维细胞分泌[18]。因此通过检测上述标志蛋白的表达情况，可间接揭示肾间质纤维化程度。本研究发现，SenA可有效抑制间充质表型特征标志物（Vimentin、α-SMA）的合成，促进上皮表型特征标志物（E-cadherin）的合成，同时还可降低肾组织中基质成分Collagen I的分泌。表明SenA对肾脏的保护作用可能通过逆转肾小管上皮细胞EMT进程而产生。Wnt/β-catenin信号通路是肾间质纤维化EMT进程的重要途径[19]。当Wnt4异常过表达时，可促进GSK-3β磷酸化，而p-GSK-3β不可激活β-catenin，因此β-catenin无法及时降解。细胞质中积累的β-catenin可通过调控核转录促进Wnt/β-catenin信号传导，诱导下游致纤维效应靶基因的过表达，促进UUO大鼠肾脏中EMT进程与ECM积累[20]，因此通过抑制Wnt4/β-catenin信号传导可逆转RIF的发生、发展。本研究结果显示，SenA可有效下调肾组织中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin的表达水平，提示SenA可能通过抑制Wnt4/β-catenin信号传导逆转RIF大鼠肾小管上皮细胞的EMT转化，继而防止肾间质纤维化，并改善肾脏损伤。

综上所述，SenA可明显改善RIF大鼠肾损伤及肾间质纤维化等病理进程，有效防止慢性肾脏病发展至终末期肾功能衰竭。而SenA对肾脏的具体保护机制可能与通过介导肾间质上皮细胞中Wnt4/β-catenin信号传导，调控细胞EMT进程有关。本研究揭示了SenA对UUO大鼠肾间质纤维化的改善能力，并同时阐释了其相关的潜在机制，为临床慢性肾损伤患者的治疗提供了新的药物研发方向，同时为中药川芎的临床肾病治疗作用增添了可靠的实验数据。