食管康对反流性食管炎模型大鼠呼吸链Complex Ⅰ、Ⅳ活性影响的实验研究

胡蓆宝，田晶晶，袁红霞

胃食管反流病（GERD）是指胃酸和（或）胃内容物反流到食管、口腔甚至呼吸道引起的一系列症状及并发症[1]。反流性食管炎（RE）属于GERD范畴，是一种常见的慢性消化系统疾病，是指胃和（或）十二指肠的内容物反流到食管，引起食管黏膜出现炎症改变、点片状糜烂，甚至形成溃疡。RE的主要临床症状表现为胸骨后烧灼感、烧心、反酸等症状。近年来，伴随着人们生活方式、饮食结构的改变，RE的发病率逐年上升[2-3]。西药治疗RE的药物包括PPI、黏膜保护剂及促胃动力药等，可以短期控制RE症状，但是长期效果不明显，而且不能从根本上解决问题，存在着复发率高等弊端[4-5]。

目前，多数中医临床学者采用不同方剂辨证论治RE，均取得了比较满意疗效，线粒体(脾)是机体细胞正常运行的“气血生化之源”，在机体炎症调控中发挥核心作用，改善线粒体功能对于炎症相关疾病的治疗具有重要意义，呼吸链complex Ⅰ和complex Ⅳ在线粒体能量代谢和维持线粒体结构、功能过程中具有非常重要的作用。本实验拟通过观察中药食管康颗粒对RE模型大鼠食管黏膜线粒体呼吸链complex Ⅰ和complex Ⅳ活性的表达情况，探讨食管康治疗RE的作用机制，从线粒体代谢角度为RE的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 64只健康的雄性Wistar大鼠购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002，常规饲养，饲养室紫外线照射消毒，饲养笼过氧乙酸消毒，保持室内相对恒温，湿度控制在50%～60%，每日自由饮用自来水，进食标准的颗粒食物。

1.1.2 实验药品 （1）食管康组：旋覆花15 g，代赭石5 g，炙甘草10 g，人参10 g，半夏10 g，延胡索15 g，黄连18 g，吴茱萸3 g等。以上药味采用中药配方颗粒(江阴市天江药业有限公司)加热水（水温100 ℃）约200 mL充分搅拌。中药药材全部由天津市南开医院提供，根据人与动物的体表面积进行换算，并煎制成1 g/mL生药的溶液，根据人与动物给药剂量换算，大鼠每日给药剂量为生药10 g/kg。（2）西药对照组：兰索拉唑肠溶片联合枸橼酸莫沙必利分散片，研为细粉末后，配制浓度为0.15 mg/mL的混悬液备用。

1.1.3 实验试剂与器械 电子天平，购自德国Sartorius公司，型号：Cubis® MSA224S-000-DA；电热恒温水浴槽，型号：HWS-24；-80 ℃低温冰箱，型号：MDF-C8V(N)；4 ℃低温冰箱，型号：HXC-106；脱色摇床，型号TS-100；电泳仪，型号BG-subMIDI；低温离心机，购自德国Sigma，型号3-30K；SDS-PAGE，凝胶成像系统UVP，型号GelDoc-It310；ChemiDoc MP化学发光成像系 统 Bio-rad， 型 号 170-8280。Anti-complexⅠ一抗和Anti-complex Ⅳ一抗购于Invitrogen公司，β-actin购自杭州华安生物技术有限公司，二抗羊抗鼠和羊抗兔IgG购自圣克鲁斯生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将64只大鼠随机分为4组：正常对照组、模型组、西药治疗组和食管康组，每组16只。采用改良后的“食管-十二指肠端侧吻合术”方法造模[6]，应用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，麻醉后将造模大鼠固定在手术板上，备皮消毒后，取上腹部正中的剑突下约0.5 cm处，纵行切开皮肤约2 cm，然后沿腹白线剪开肌层和腹膜，将胃提出，剪断肝胃韧带，显露食管，分离食管下段迷走神经及血管，丝线结扎贲门，固定食管，预防食管回缩，从贲门上0.3 cm处切断食管；缝合贲门并荷包包埋入胃中，保留全胃；在距幽门1 cm处侧壁避开血管纵行切开十二指肠壁约0.5 cm；随后将食管下端全层与十二指肠切口行端侧吻合（6/0带线缝合针缝合），前后左右四壁四针缝合即可，缝合之后尽量轻轻将胃、食管、十二指肠按原位置回纳，以避免感染及粘连；关腹前于腹腔内注射盐酸左氧氟沙星注射液（1.5 mg/kg，扬子江药业集团有限公司），然后进行分层缝合，迅速关腹，消毒皮肤。术后24 h禁食不禁水，术后3 d内，每天每只大鼠腹腔注入盐酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg，且给予注射用葡萄糖盐水饮用，此后常规喂养。将成模的动物随机分为三组：模型组、食管康组及西药组。

1.2.2 药物干预 正常对照组16只大鼠与各治疗组同日开始，用生理盐水1 mL/100 g体重进行灌胃，2次/d，与各治疗组同时处死。模型对照组16只大鼠于造模后第6天用生理盐水1 mL/100 g体重进行灌胃，2次/d，与治疗组同日处死。食管康组、西药治疗组2组，每组16只大鼠。于造模术第6天开始，用相应药液1 mL/100 g体重进行灌胃，2次/d，治疗14天后，处死各组动物，开始进行指标检测。

1.2.3 处死及取材 动物禁食不禁水1天后处死，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，开腹后尽快取出食管纵切一分为二，一份放入10%福尔马林液中送病理科，另一份称重之后用生理盐水冲洗，放入液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 观察指标及指标检测方法 （1）食管黏膜的肉眼表现：各组大鼠麻醉之后，迅速进行开腹，取自胃与食管交界上0.5 cm处向咽喉部方向截取长约1.5～2.0 cm的食管，用冰生理盐水将食管腔漂洗后，肉眼观察食管大体的表现，并进行肉眼RE分级，之后迅速将食管组织放入10%福尔马林固定液中，防止自溶；（2）病理形态学观察：将固定好的食管组织送病理科制备食管组织石蜡切片进行HE染色，在光学显微镜下观察病理组织学分级（参考2004年由中华医学会消化内镜分会颁布的《反流性食管炎诊断及治疗指南》见表1、表2。）（3）食管组织complex Ⅰ、Ⅳ活性的检测：应用Western blotting法测定标本中大鼠食管组织complex Ⅰ、Ⅳ的活性，测定的过程按照试剂盒说明书进行严格操作。

表1 反流性食管炎肉眼表现分级

1.3 统计学方法 使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡原因分析 正常组大鼠在实验过程中无死亡，造模组大鼠于处死前，48只大鼠共死亡8只，死亡率约为16.67%。其中2只死于弥漫性腹膜炎，2只死于吻合口狭窄，1只死于肠梗阻，3只死于吸入性肺炎。剩余大鼠各组为模型组12只，食管康组15只，西药组13只。

2.2 食管黏膜肉眼的表现 正常组大鼠的食管黏膜光滑，无充血水肿表现；灌胃14天后，模型组大鼠食管下段黏膜水肿，颜色鲜红，可见点片状充血、糜烂，部分融合为溃疡；食管康组大鼠食管黏膜结构光滑，少数食管下段黏膜轻度充血水肿，未见糜烂及溃疡；西药组大鼠食管黏膜结构相对完整，部分食管可见条索状充血，少数可见条索状糜烂，未见明显溃疡。各组大鼠RE肉眼分级分布及积分情况见表3。

2.3 食管黏膜光镜下表现 正常组大鼠食管光镜下黏膜层表面为完整的鳞状上皮，其基底的细胞层有少许内分泌细胞；模型组大鼠食管黏膜层有明显的炎性细胞浸润，局部黏膜糜烂；食管康组大鼠食管黏膜上皮恢复，炎性细胞明显减少；西药组大鼠食管黏膜可见炎细胞弥漫水肿，基层仍可见炎细胞浸润，各组大鼠RE光镜下分级分布及积分情况见表4，图1～4。

表4 各组大鼠食管黏膜病理组织学分级

图1 正常组大鼠食管黏膜（×400）

图2 模型组大鼠食管黏膜（×400）

图3 西药组大鼠食管黏膜（×400）

图4 食管康组大鼠食管黏膜（×400）

2.4 食管组织complexⅠ、Ⅳ活性的检测 模型组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性较正常组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），食管康组及西药组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性较模型组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），食管康组与西药组比较，大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表5，图 4，5。

表5 complexⅠ、Ⅳ灰度值参数与内参β-actin灰度值参数比值

图4 各组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性表达情况

图5 各组大鼠食管组织complexⅠ、Ⅳ活性表达情况

3 讨论

中医学并无RE的病名，根据该病的主症及临床表现归于中医“反胃”“吐酸”“呕吐”“噎膈”等范畴。RE的病位主要在食管，与肝、脾、胃等关系密切，基本的病机为脾胃虚弱，而病机之关键则为中焦气机升降的失常。课题组成员提出“脾胃虚弱”为RE的发病之本，病机关键为“肝胃不和，胃气上逆”，情志不畅、饮食不节、劳倦或久病等致脾胃虚弱，肝在五行属木,主动,主升，主疏泄，肝为血之藏,司情志，喜条达、恶抑郁。若脾胃虚弱，肝木偏亢而克制脾土，即“土虚木乘”，而致中焦气机升降失常，脾胃运化功能失职，气机郁结，肝气夹胃浊上逆,出现肝胃不和，胃气上逆，发生RE。故临证中食管康颗粒治疗各种类型的RE疗效显著[7-8]。

食管康颗粒是在《伤寒论》中经方“旋覆代赭汤”的基础上加左金丸，芍药甘草汤，再佐以延胡索，郁金，丹参而成，其方证要点为脾胃虚弱，肝胃不和，胃气上逆。旋覆花降气化痰，降逆止呕，其质轻而气主下，可降胃气无伤脾碍胃之弊，并有疏肝中郁结之功；代赭石功善降逆止呕，下气降痰，该药重镇降逆可疗胃气不降，开胸膈，坠痰涎治喘息，平肝降胃镇冲，治冲气上逆，与旋覆花合用，佐助降逆化痰止呕之效，降逆化痰，益气和胃；半夏辛开，燥功善降逆和胃止呕，燥湿化痰；黄连清胃热，泻肝火；吴茱萸疏肝和胃，降逆止呕，二者为《丹溪心法》中之左金丸，辛开苦降，肝胃同调，佐君药增强清肝和胃之功，共为臣药；白芍养肝血，益肝阴，缓急止痛；由于此病多病程较长，久病则入络化瘀，加丹参活血止痛，郁金清热疏肝，解郁除烦，共为佐药；炙甘草健脾和胃，调和诸药。纵观全方，配伍严谨，协调升降，平调气血，降中有升，升中有降，降中有补，标本兼顾，诸药配合，共成健脾益气，疏肝和胃，达到重建中焦气机的升降功能，使气逆得除，脏腑和谐状态得复。

线粒体是半自主性的细胞器，是机体细胞正常运行的“动力工厂”，可以氧化分解全身的营养物质（水谷精微），为全身细胞的生命活动提供重要的能量[9]，是机体细胞正常运行的“气血生化之源”,也就是说机体细胞的中医之“脾”。与线粒体呼吸链的电子传递偶联形成的跨线粒体内膜质子梯度是生命活动中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成最主要的动力。线粒体是通过三羧酸循环、氧化磷酸化的过程, 把营养物质(水谷精微)氧化生成ATP(气)，同时利用甘氨酸和琥珀酸单酰CoA，共同合成血红素(“血”)，可见，线粒体(脾)是机体细胞正常运行的“气血生化之源”。

呼吸链位于线粒体内膜上，糖、脂肪、蛋白质在代谢过程中形成电子，通过线粒体呼吸链依次传递，最终产生ATP，为组织细胞提供能量。线粒体内膜呼吸链复合体包括complexⅠ(NADH泛醌氧化还原酶)、complexⅡ(琥珀酸泛醌氧化还原酶)、complex Ⅲ(细胞色素C还原酶)、complexⅣ(细胞色素C氧化酶)、complexⅤ(ATP合成酶)及一系列的辅酶[10-11]，线粒体呼吸链复合物的活性浓度变化直接反映着线粒体呼吸功能的变化[12]，其可保护线粒体膜结构的完整性，改善氧化磷酸化的功能，对维持机体正常的能量代谢有重要意义[13-14]。

呼吸链complex Ⅰ是线粒体呼吸链的首个门户，在线粒体能量代谢过程中具有非常重要的作用，其在电子传递的过程中泵出偶联质子，形成了线粒体基质和膜间隙的质子梯度，从而可以促进线粒体ATP的合成[15-16]。呼吸链complex Ⅳ位于呼吸链的末端，催化细胞色素氧化，亦可以促进ATP的合成，其酶活性的发挥对维持线粒体结构、功能有很重要的意义。研究证明[17]，脾虚组大鼠脾脏的线粒体complex（Ⅰ-Ⅳ）的活性均明显低于正常组，证实脾虚证中脾脏组织的ATP合成能力出现障碍，考虑与其氧化磷酸化过程complex活性的改变有相关性。

综上所述，RE模型组大鼠食管组织中complex Ⅰ、Ⅳ活性较正常组明显降低，而经过食管康颗粒健脾益气，疏肝和胃治疗后，达到重建中焦气机的升降功能，使食管组织中complex Ⅰ、Ⅳ活性升高，提示食管康颗粒治疗RE的机制，可能为增加机体组织线粒体呼吸链酶的活性，保持呼吸链的完整性，提高线粒体氧利用的能力和氧化磷酸化的功能，从而改善线粒体膜结构的完整性，改善食管下括约肌的正常舒缩，减少反流的发生，从而达到治疗RE的目的。