蒲公英甾醇调控膀胱癌T24细胞迁移与侵袭能力的作用及机制研究

陈 翔，郑 雷，陈大可，张 杰

关键字：蒲公英甾醇；膀胱癌；迁移与侵袭；Akt/mTOR；SDF-1/CXCR4

膀胱癌是临床常见的泌尿系统肿瘤，其发病部位通常位于膀胱黏膜，其发病率在泌尿系统恶性肿瘤中高达90%以上[1]。膀胱癌好发于中老年群体，其中男性患者数量远高于女性。临床通常表现为：血尿，膀胱刺激征，且伴有间歇性、无痛性，严重影响患者的生活质量[2]。我国膀胱癌患者中90%以上是膀胱尿路上皮癌，其中肌层浸润性约占30%，非肌层浸润性约占70%，但其中约10%～20%的非肌层浸润性患者可进展为肌层浸润性膀胱癌，通常采用根治性膀胱癌切除术治疗肌层浸润性膀胱癌，但易远处转移、复发，手术失败率较高，五年生存率并不理想[3-4]。因此如何减少膀胱癌复发及控制癌细胞浸润和转移，是有效降低患者病死率的关键。研究发现，通过化疗可明显改善膀胱癌患者的预后及生存，但因化疗不良反应严重，且易产生耐药性[5]。因此寻找新的抗肿瘤药物对于维护膀胱癌患者的生命健康具有重大意义。近年来，天然化合物因其疗效明确、不良反应小等特点，受到越来越多的关注。在已批准上市用于抗肿瘤的药物中，约有70%来源于天然植物[6]。蒲公英为菊科植物蒲公英（TaraxacummongolicumHand Mazz.）、碱地蒲公英（T.sinicumKitag.）或同属数种植物的干燥全草，始载于《唐本草》，味苦甘、性寒、无毒，有清热解毒、消肿散结、利尿通淋等功效[7]。现代药理发现，蒲公英具有抗菌、抗炎、利胆保肝及增强免疫等作用，临床常用于疖痈、急性乳腺炎或感冒等疾病的治疗[8]。近年来研究发现，蒲公英具有良好的抗肿瘤活性[9]，其黄酮、酚酸、植物甾醇类等成分在抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎等方面均表现出明显的优势[10]。其重要成分蒲公英甾醇对膀胱癌是否具有良好的生物活性目前尚不清晰。本课题拟体外培养膀胱癌细胞并加入蒲公英甾醇进行干预，考察蒲公英甾醇对膀胱癌的作用及机制，为膀胱癌的药物研发提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 蒲公英甾醇（≥98%，批号127-22-0），购自成都瑞芬思生物科技有限公司；FBS、胰蛋白酶、P/S、RPMI 1640培养基，购自美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂、PBS、TBS，购自上海碧云天公司；Transwell小室，购自美国Corning公司；Matrigel基质胶，购自美国BD公司；基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9 ELISA试剂盒，购自上海酶联生物公司；蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、CXCR-4兔抗人一抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，购自Cell Signaling Technology公司；ECL发光试剂盒，购自美国Pierc公司；细胞工作台、细胞孵育箱、电泳和转膜仪、酶标仪，购自美国Bio-rad公司；倒置荧光显微镜，购自日本Nikon公司。

1.2 细胞株 人膀胱移行细胞癌T24细胞株，由上海细胞研究所提供。配制含10% FBS、1% P/S的RPMI 1640培养基，随后复苏细胞，并在37℃、5%CO2条件下培养。隔日更换一次培养基，待细胞融合80%～90%进行传代，至2～3代时开展细胞实验。

1.3 划痕实验 取对数生长期的膀胱癌细胞置入6孔板中进行培养，待细胞融合至80%～90%时用200 μL移液枪头在中间划直线，确保每次划痕宽度一致。采用无菌PBS液清洗孔内脱落细胞，再加入完全培养基进行培养并加入不同浓度（10、20及40 μg/mL）的蒲公英甾醇进行干预。分别在划痕0 h及24 h后置显微镜下进行观测，评估细胞迁移情况，并根据划痕愈合率对给药前后细胞迁移能力进行考察。

1.4 Transwell小室法 取对数生长期的膀胱癌细胞，将其稀释到5×104浓度后取200 μL加入到包被有Matrigel的Transwell上室，各组孔内分别滴加不同浓度（10、20及40 μmol/L）的蒲公英甾醇进行干预，同时在下室中加入完全培养基，随后放置在细胞孵育箱中继续培养24 h。培养结束，用棉签轻柔擦净上室面未穿过膜层的膀胱癌细胞，并置入甲醛进行固定。20 min后常温晾干，采用结晶紫染色20 min，用预冷的PBS进行清洗，并放置显微镜下进行观测。

1.5 ELISA法检测 取细胞上清液，低温经3500 r/min离心5 min后，分离上层液并将其储存在-20 ℃条件下。根据试剂盒说明书检测上清液中MMP-2及MMP-9的含量。

1.6 Western boltting法检测 将细胞低温裂解后制备细胞蛋白样本，对蛋白浓度进行测定。将样本根据10% SDS-PAGE进行电泳分离，随后在转膜仪中将凝胶上的蛋白转印到PVDF膜。PBS漂洗、加入5% BSA封闭后滴加一抗（SDF-1、CXCR4、p-Akt、Akt、p-mTOR 及 mTOR，1:1000），放置在-4 ℃冰箱中孵育过夜。12～18 h后在室温中加入二抗进行孵育30 min，PBS漂洗后滴加ECL液进行化学发光，放置在成像仪中显影成像。使用Image J软件分析各组蛋白灰度值，以β-Tubulin作为内参进行比对。

1.7 统计学处理 数据采用SPSS 18.0软件包分析，计量资料的数据以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组T24细胞迁移能力比较 在膀胱癌细胞中加入不同浓度（10、20及40 μg/mL）蒲公英甾醇均可抑制膀胱癌细胞的迁移能力。与空白对照组比较，各蒲公英甾醇给药组均可显著降低膀胱癌细胞的迁移率，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 各组T24细胞的迁移能力比较

2.2 各组T24细胞侵袭能力比较 在膀胱癌细胞中给予蒲公英甾醇干预处理后，其侵袭能力也降低。与空白对照组比较，不同浓度（10、20、40 μg/mL）蒲公英甾醇均可明显减少侵袭细胞数量，差异有统计学意义（P＜0.05），其中以20及40 μg/mL的蒲公英甾醇作用最优。见图2。

图2 各组T24细胞的侵袭能力比较

2.3 各组T24细胞SDF-1及CXCR4的表达水平比较 在调控SDF-1表达方面：与空白对照组比较，不同浓度（10、20及40 μg/mL）蒲公英甾醇均可明显降低膀胱癌细胞中SDF-1的表达水平（P＜0.05），其中以20及40 μg/mL蒲公英甾醇下调作用最为显著（P＜0.01）；在调控CXCR4表达方面：与空白对照组比较，20及40 μg/mL的蒲公英甾醇可显著降低膀胱癌细胞中CXCR4的表达水平（P＜0.01），而10 μg/mL的蒲公英甾醇组与空白对照组比较未见明显差异（P＞0.05）。见图3。

2.4 各组T24细胞p-Akt及p-mTOR的表达水平比较 在调控Akt活化方面：与空白对照组比较，不同浓度（10、20及40 μg/mL）蒲公英甾醇均可明显降低膀胱癌细胞中p-Akt的表达水平（均P＜0.05），其中以20及40 μg/mL的蒲公英甾醇下调作用最显著（P＜0.01）；在调控mTOR活化方面：与空白对照组比较，20及40 μg/mL的蒲公英甾醇可显著降低膀胱癌细胞中p-mTOR的表达水平（P＜0.01），而10 μg/mL的蒲公英甾醇组与空白对照组比较未见明显差异（P＞0.05）。见图4。

图3 各组T24细胞中SDF-1及CXCR4蛋白表达水平比较

图4 各组T24细胞中Akt及mTOR蛋白活化水平比较

3 讨论

膀胱癌属临床高发病率的肿瘤性疾病，严重影响患者生理机能及生活质量，甚至导致死亡。《膀胱癌诊疗规范2018》表明，膀胱癌发病率在全球肿瘤疾病中高居11位，死亡率位于13位，在男性恶性肿瘤中排第9位[11]。研究发现，膀胱癌的发病可能与膀胱炎症、吸烟、遗传等因素有关[12]，而其中致癌基因与抑癌基因参与了膀胱癌的发生、发展[13]。中医通常将膀胱癌归属于“尿血”“血淋”、“癃闭”等范畴，瘀毒内蕴是其重要病机，通常采用活血化瘀、化痰散结、排毒利尿等治法进行干预[14]。西医在膀胱癌治疗中方法多样，但无论手术治疗还是放、化疗等对身体损伤严重，预后亦不理想。而中药在对抗膀胱癌的过程中取得了长足进步，较好地弥补了现代医学不足之处[15]。近年来发现膀胱癌转移是膀胱癌致死的关键，因此针对抗膀胱癌细胞侵袭及迁移的药物发现成了研究热点[16]。基于蒲公英具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋等功效[7]，笔者深入考察了其重要成分蒲公英甾醇干预膀胱癌细胞迁移及侵袭的作用与机制。

肿瘤微环境主要包括局部的各类细胞、细胞外基质及相关细胞因子等，其中细胞外基质作为肿瘤的组织学屏障，通过使其降解可促进肿瘤细胞迁移与侵袭[17]。MMP是降低细胞外基质的关键蛋白酶，对维持机体正常生理功能具有重要意义。其中MMP-2及MMP-9是目前的研究热点，其可通过破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，继而加速肿瘤细胞的迁移与侵袭[18]。本研究结果显示，蒲公英甾醇可以抑制T24细胞中MMP-2及MMP-9的分泌，同时抑制了T24细胞的迁移率及侵袭细胞数。提示蒲公英甾醇通过减少膀胱癌细胞MMP-2及MMP-9的分泌，继而抑制其迁移及侵袭能力。SDF-1是趋化因子家族的重要成分，与机体心血管及神经系统生长发育密切相关，近年来发现SDF-1对肿瘤细胞增殖与迁移也发挥调控作用[19-20]。SDF-1与其受体CXCR4结合后可激活下游信号传导，释放多种效应因子，继而参与调控细胞增殖、趋化、迁移及黏附等功能[21]。活化后的SDF-1/CXCR4信号通路可有效促进Akt/mTOR信号传导[22]，而通过抑制Akt和mTOR磷酸化，可有效降低MMP-2及MMP-9表达水平，防止膀胱癌细胞的迁移与侵袭[23-24]。已有研究证实，SDF-1/CXCR4在膀胱癌中呈高水平表达状态，参与介导膀胱癌细胞的侵袭能力[25]。本研究结果显示，膀胱癌细胞中SDF-1、CXCR4、p-Akt及p-mTOR的表达水平可同时受蒲公英甾醇下调而降低。由此提示，蒲公英甾醇可通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路，继而调控Akt/mTOR信号传导，最终干扰膀胱癌细胞中MMP-2及MMP-9分泌。

综上所述，膀胱癌细胞具有高度的迁移与侵袭能力，而该类细胞功能可受蒲公英甾醇逆转。其相关具体机制主要为：蒲公英甾醇通过抑制膀胱癌细胞中SDF-1/CXCR4信号通路，降低下游通路中Akt及mTOR活化水平，减少了MMP-2、MMP-9分泌，继而削弱了膀胱癌细胞的迁移与侵袭能力。