火龙果茎中3种主要甾醇的提取工艺研究①

付调坤 周 伟 夏 文 付 琼 李积华③

(1 中国热带农业科学院农产品加工研究所/农业农村部热带作物产品加工重点实验室 广东湛江524001;2 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 广东湛江524091;3 海南省果蔬贮藏与加工重点实验室 广东湛江524001)

火龙果（Hylocereus undatus）是仙人掌科三角柱属（又名量天尺属）的果用栽培品种，其茎深绿色，粗壮，三棱状，棱边缘有刺座，花大型，浆果长圆形，原产于巴西、墨西哥等中美洲热带沙漠地区［1]，国内目前已在广西、广东、海南、福建等地区大规模种植。火龙果茎为肉质茎，横切面为三角形，表层覆盖较厚的角质层，色泽随成熟老化由浅黄绿色变为深绿色，角质层内部是凝胶状组织。火龙果种植行业每年修剪下的火龙果茎的量与果实的产量相当，火龙果茎目前作为一种废弃物被扔掉，对其利用很少［2]。

植物甾醇（Phytostero） 是一种类似于环状醇结构的天然活性物质，其结构与动物间的胆固醇相似，是植物代谢的一个终产物。它广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中，也存在于其他植物性食物如蔬菜、水果中［3]。火龙果茎中含有多种植物甾醇［4]，如蒲公英甾醇、菜籽甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇、豆甾醇等。植物甾醇是一类具有生理活性的物质，具有多种功效，首先它能够抑制人体对胆固醇的吸收及生化合成，促进胆固醇的降解代谢，降低胆固醇吸收［5-6]。因此，植物甾醇可用于预防治疗冠状动脉粥样硬化类的心脏病［7-8]。其次，植物甾醇还具有抑制血小板凝聚和抑制癌细胞增殖的作用，以及抗炎、抗菌等功能，可促进伤口愈合，增强毛细血管循环，对治疗溃疡有明显的疗效，被用作治疗各种癌症如乳腺癌、前列腺癌、肠癌等的辅助治疗药物［9-10]。同时，植物甾醇中含有亲水基团和亲油基团，具有良好的乳化性，可用作外观改良剂、稠度改良剂、粘度控制剂、缓冲剂和微乳化剂等。另外，植物甾醇还具有良好的抗氧化性，可作食品添加剂（抗氧化剂、营养添加剂等）；也可作为动物生长剂原料，促进动物生长［11-12]。综上所述，植物甾醇在医药、食品、化妆品等领域中都有广泛应用，具有极大的开发价值［13]。

随着国家对农业可再生天然资源开发利用的重视，热带农作物废弃物资源的高值化应用和废弃物回收再利用成为研究的热点。本文以大宗热带废弃资源火龙果茎为研究对象，采用超声波辅助萃取法来提取火龙果茎中的3种主要甾醇，并对其提取工艺进行优化［14-15]。为火龙果茎的深度开发利用提供理论依据和技术参考，也为热带农作物及其废弃物的高值化利用提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

火龙果茎原料：火龙果茎品种为台农3号（玫瑰红），取自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所。

1.1.2 仪器

真空冷冻干燥机（德国CHRIST，ALPHA2-4），精密分析天平（德国赛多利斯，CPA225D），高速多功能粉碎机（武义海纳，CS-700），超声波反应器（上海科导，SK2210LHC），低温高速离心机（德 国Sigma， 3-30K）， 氮 吹 仪（美 国Or‐ganomation，N-EVAP-24），高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20A）。

1.1.3 试剂

麦角甾醇、豆甾醇、β‐谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇等6种甾醇标准品（上海源叶生物科技有限公司），95%乙醇（分析纯，广东光华科技股份有限公司），无水甲醇（分析纯，西陇科学股份有限公司），甲醇（色谱纯，西格玛奥德里奇贸易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 火龙果茎原料的预处理

将新鲜的火龙果茎洗净后去刺，去除中心的木质化茎，将余下的肉质茎部分切成3～5 mm 的小块，然后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冻干条件为-80℃，0.1 mbar，冷冻干燥48 h 后将冻干好的火龙果茎用高速粉碎机打成粉末，即为火龙果茎冻干粉末，装入自封袋中，放入干燥器中保存备用。

1.2.2 火龙果茎甾醇样品的处理

准确称取一定量的火龙果茎冻干粉末于三角瓶中，按一定液固比（mL/g）加入95%乙醇置于超声波反应器中超声提取，然后高速离心（10000 r/min×15 min）除去滤渣取上清液，即为火龙果茎甾醇提取液。

1.2.3 高效液相色谱法测火龙果茎甾醇含量

（1） 色谱柱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇；流速：0.7 mL/min；柱温：35 ℃，检查波长：210 nm，进样量：20 μL。

（2） 各种甾醇标准曲线测定 通过预实验，在本研究的实验条件下，火龙果茎中总共检测到5种甾醇，分别是麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇和蒲公英甾醇。准确称量这5种甾醇的标准品各25 mg，置于25 mL容量瓶中，无水甲醇溶解定容，配置成1 mg/mL 的甾醇标准品溶液。用逐级稀释法配置不同浓度的标准甾醇溶液，分别准确移取1、2、3、4、5 mL 甾醇标准品溶液于5 mL 容量瓶中，用无水甲醇定容。按照色谱条件进样测定，每个浓度标准品溶液进行3次进样测定，进样量为20 μL。分别以峰面积、甾醇标准品浓度为纵坐标、横坐标，绘制标准曲线。

（3） 分别精密称取1 mg的麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、蒲公英甾醇标准品，用无水甲醇溶解并混合，定容至2 mL。按色谱条件进样测定，得到混标色谱图。

（4） 将1.2.2 中的火龙果茎甾醇提取液用氮吹仪吹48 h，吹干后用无水甲醇溶解，定容至3 mL，准确移取1.5 mL 样品至样品瓶中，按照色谱条件进样测定，每个样品进行3 次进样测定，进样量为20 μL。

1.2.4 单因素实验

在预实验基础上以95%乙醇为最佳提取溶剂，超声功率固定100 W，选取超声提取温度、液固比（mL/g）、超声提取时间3个因素，考察各因素对火龙果茎中甾醇提取含量的影响，确定其最佳因素水平。其他因素条件固定，依次分别以超声提取温 度（35、40、45、50、55、60℃）、液 固比（mL/g）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）和超声提取时间（30、60、90、120、150、180 min）为单因素，在不同水平上进行单因素分析，以确定响应曲面的最优因素水平。

1.2.5 响应面实验

经过单因素实验考察，确定Box-Behnken 响应面法考察的因素分别为超声提取温度、液固比（mL/g）和超声提取时间。采用3 因素3 水平的Box-Behnken 响应面分析法进行实验设计，设定的因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素和水平编码值

1.2.6 数据处理

实验数据采用Design Expert 8.0 软件进行统计分析，以Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 各种甾醇标准曲线

分别以峰面积、甾醇标准品浓度为纵坐标、横坐标，绘制标准曲线。其中麦角甾醇曲线的回归方程为：y=11417858.5000x-233800.3000，相关系数R2=0.9996；豆甾醇曲线的回归方程为：y=6694590.5000x+208602.3000，相关系数R2=0.9906；β-谷甾醇曲线的回归方程为：y=5074077.0000x-50681.6000，相关系数R2=0.9992；菜籽甾醇曲线的回归方程为：y=7931156.5000x-135202.7000 相关系数R2=0.9946；蒲公英甾醇曲线的回归方程为：y=14169061.5000x-165694.7000 相关系数R2=0.9906，所得回归方程线性关系均良好。

2.2 HPLC色谱图

从图1、2对比可知，图2中的5个峰的出峰时间与图1 中的5 个峰的出峰时间一一对应，因此可以确定，样品的HPLC 色谱图中，按出峰时间先后顺序分别为：麦角甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇。但是由于样品中可能含有其他杂质，所以保留时间稍有差别。

图1 5种甾醇的混标HPLC色谱图

图2 样品的HPLC色谱图

根据2.1 中的各甾醇标准曲线的回归方程计算，得到样品中不同甾醇的含量，见图3。

由图3可知，火龙果茎中甾醇含量豆甾醇＞麦角甾醇＞β-谷甾醇＞蒲公英甾醇＞菜籽甾醇，故选取含量最高的3种甾醇（豆甾醇、麦角甾醇、β-谷甾醇）作为所需的目标甾醇。

2.3 单因素实验

2.3.1 超声提取温度对火龙果茎甾醇含量的影响

从图4可以看出，麦角甾醇的含量随着温度的升高而增加，在45℃时达到最高值，45℃之后麦角甾醇的含量逐渐减小然后趋于平稳；豆甾醇的含量在35～50℃波动不大，55℃时达到最高值，55℃之后呈下降趋势；β-谷甾醇的含量随着温度的升高而增加，在50℃达到最高值，之后β-谷甾醇的含量都是随着温度的增加呈下降趋势然后趋于平稳；总的来说，这3种甾醇的含量随着温度的升高先呈上升趋势，到达最高值之后开始下降逐渐趋于平稳，造成这种趋势的原因可能是随着温度的升高，甾醇的溶解度增大，一开始呈上升趋势，随着温度继续升高，甾醇分子的内部结构被破坏了，导致甾醇性质发生改变［16]，所以达到最高值后甾醇含量开始呈下降趋势。麦角甾醇在超声提取温度为45℃时提取含量最高；豆甾醇在超声提取温度为55℃时提取含量最高；β-谷甾醇在超声提取温度为50℃时提取含量最高；综合来看，麦角甾醇与豆甾醇在50℃时的提取含量与各自的最高提取含量相差不大，所以选取温度50℃为最佳超声提取温度。

图3 高效液相法测样品中不同甾醇的含量

2.3.2 液固比对火龙果茎甾醇含量的影响

结果见图5。

从图5可知，麦角甾醇的提取含量随着液固比的增加而增加，当液固比为20∶1 时，达到最高值。β-谷甾醇的提取含量随着液固比的增加也呈现上升趋势，在液固比为30∶1 时，达到最高值。这可能因为是随着提取溶剂体积的增加，样品与溶剂混合的更充分，溶出的植物甾醇含量也随之增多，所以麦角甾醇和β-谷甾醇的提取含量也随之提高，当麦角甾醇和β-谷甾醇的液固比分别为20∶1 和30∶1 时，达到其最高提取含量，这时甾醇已经基本提取完全［17]，继续增大液固比反而会降低甾醇浓度。豆甾醇的提取含量在液固比10∶1为最高值，之后开始减小，15∶1～30∶1 呈缓慢上升趋势逐渐趋于平稳，导致出现豆甾醇含量下降趋势的原因可能是有其他杂质被提取出来，所以豆甾醇含量在1∶10 之后出现下降趋势，1∶15～1∶30 呈缓慢上升趋势，可能是豆甾醇被提取完全了。综合来看，液固比为30∶1时，β-谷甾醇的提取含量最高，且豆甾醇和麦角甾醇在此液固比下的提取含量相比各自的最高提取含量相差较小，故选取30∶1作为最佳提取液固比。

图4 超声提取温度对火龙果茎甾醇含量的影响

图5 液固比对火龙果茎甾醇含量的影响

2.3.3 超声提取时间对火龙果茎甾醇含量的影响

结果见图6。

图6 超声提取时间对火龙果茎甾醇含量的影响

从图6 中可知，麦角甾醇在提取时间为60 min时提取含量最高，然而豆甾醇和β-谷甾醇相比麦角甾醇需要更多的提取时间，分别在180 和150 min 得到最高的提取含量。这可能是因为提取时间过短时，火龙果茎的细胞壁没有完全破裂，其中的豆甾醇和β-谷甾醇溶解不充分，使得其提取不够完全，而随着超声提取时间的增加，细胞破碎程度增加，细胞内部的甾醇物质开始向外扩散，因此甾醇的提取含量增加。但当甾醇达到其最高提取含量时，随着超声提取时间的增加，甾醇可能会被破坏，从而使提取含量降低［18]。综合来看，β-谷甾醇在超声提取时间为150 min时提取含量最高；麦角甾醇与豆甾醇在超声提取时间为150 min时的提取含量与各自的最高提取含量相差不大，所以选取150 min作为最佳超声提取时间。

2.4 响应面实验

本次实验的评价指标为麦角甾醇含量、豆甾醇含量、β-谷甾醇含量。因为选取的3个指标（麦角甾醇含量、豆甾醇含量、β-谷甾醇含量）的重要性一样，所以以Y表示实验中指标的测定值指标隶属度＝该公式中Y表示指标值，Ymax表示最大指标值，Ymin表示最小指标值，直接将上述的3个指标的隶属度相加作为综合评分，利用综合评分对实验结果进行分析。Box-Behnken设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

采用Design Expert 8.0 软件对实验结果进行回归分析，得到回归方程如下：

综合评分＝2.14＋0.59A－0.23B＋0.26C-0.71A2－0.19B2－0.16C2－0.014AB＋0.062AC＋0.26BC

回归方程一次项中各项系数绝对值的大小反映了各因素对响应值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由方程可知，影响甾醇指标性成分的因素的主次顺序为A＞C＞B。进一步对方程进行回归方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3的分析结果可以看出，模型F＝7.98，p＝0.0061＜0.01，说明回归方程极显著，拟合度很好，实验具有很高的可信性和准确性；失拟项F＝3.62，p＝0.123＞0.05（不显著），说明实验误差很小，因此可以用此模型分析和预测火龙果茎中甾醇的提取工艺的结果。由表3 中F值可知，模型中一次项影响甾醇含量的主次因素是A＞C＞B，交互项均不显著，二次项A2极显著（p＜0.01），其余均不显著。将因变量与另外2个因素拟合为三维曲面图，因为只能表达含2个因素变量的函数，所以固定3个因素之一为中值，将中心点值代入二次回归模型方程得到新方程，根据新模型方程得到响应面三维图，结果见图7。

经过Box-Behnken 实验设计优化提取条件，得到最优工艺条件为：超声提取温度53.61℃、超声提取时间168.45 min、液固比17.10∶1，试验预测综合评分为2.3743。依据最优工艺条件进行验证实验，得到最优工艺条件下火龙果茎甾醇含量为：麦角甾醇含量为179.08 mg/hg，豆甾醇含量为156.02 mg/hg，β-谷甾醇含量为54.89 mg/hg，总甾醇含量为389.99 mg/hg，综合评分为2.3633，这与理论综合评分2.3743 相比无显著性差异。因此采用Box-Behnken 实验设计优化得到的甾醇提取工艺准确可靠。

3 结论

植物甾醇作为一种具有重要生理功能的活性物质，有着广泛的用途。火龙果茎作为一种农业废弃资源，是提取植物甾醇的一个良好来源，以它为原料提取甾醇，既可以实现农业废弃资源的高值化应用，又可实现产业的可持续发展。本研究以火龙果茎为原料，采用超声波辅助萃取法来提取火龙果茎中的3 种主要甾醇（麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇），通过单因素和响应面实验，对影响3 种主要甾醇提取含量的主要因素进行研究。实验结果表明，影响火龙果茎甾醇含量的主次因素是超声提取温度＞超声提取时间＞液固比。通过响应面分析法优化提取工艺，得到的最优工艺条件为：以95%乙醇为提取溶剂，超声功率100 W，超声提取温度53.61℃、超声提取时间168.45 min、液固比17.10∶1；在最优工艺条件下火龙果茎甾醇含量为：麦角甾醇含量为179.08 mg/hg，豆甾醇含量为156.02 mg/hg，β-谷甾醇含量为54.89 mg/hg，总甾醇含量为389.99 mg/hg。本研究首次同时提取火龙果茎中的3种主要甾醇，为火龙果茎甾醇的进一步研究开发提供基础数据和理论参考。

图7 3种因素对综合评分的响应面图